第二章細胞生物學技術細胞形態結構的觀察方法細胞組分的分析方法細胞培養、細胞工程與顯微操作技術§1細胞形態結構的觀察方法光學顯微鏡技術電子顯微鏡技術掃描隧道顯微鏡光學顯微鏡：以可見光（或紫外線）為光源。電子顯微鏡：以電子束為光源。1.構成：①照明系統②光學放大系統③機械裝置2.原理：經物鏡形成倒立實像，經目鏡進一步放大成像。（一）普通光學顯微鏡1.物鏡轉換器2.接物鏡3.游標卡尺4.載物臺5.聚光器6.彩虹光闌7.光源8.鏡座9.電源開關10.光源滑動變阻器11.粗調螺12.微調螺旋13.鏡臂14.鏡筒15.目鏡16.標本移動螺旋3.分辨率：指區分開兩個質點間的最小距離。分辨距離越小，則分辨能力越高。R=0.61λ/N．A．λ為入射光線波長；N．A．（鏡口率）

＝ｎsinα/2，n=介質折射率；α=物鏡鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）。思考：如何提高顯微鏡的分辨能力？N·A：顯微鏡物鏡的鏡口率—光學性能指標，每個物鏡上都標有其鏡口率的數值）。幾種介質的折射率物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質折射率的限制，不可能有更大提高。所以科學家們從另外兩個途徑來改進顯微鏡：換用短波長的“照明光源”，來提高分辨能力。如：紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。應用特殊光學效應，增強反差，來提高分辨能力。（二）熒光顯微鏡

Fluorescencemicroscope特點：光源為紫外線，波長較短，分辨能力高于普通顯微鏡；有兩個特殊的濾光片；照明方式通常為落射式。（二）熒光顯微鏡

Fluorescencemicroscope原理：以紫外光為光源，使被檢材料中的熒光物質激發出熒光，從而對細胞內某些物質進行定性和定位分析。熒光現象有兩種：（１）自發熒光：細胞內某些天然熒光物質被紫外光照射所激發的熒光，例如葉綠素（血紅色自發熒光）；（２）誘發熒光：在細胞中加入熒光染料（熒光素），與細胞內某種特定成分結合在一起，經紫外光照射激發出熒光。例：熒光染料吖啶橙，可使RNA發出紅色熒光，而使DNA發出綠色熒光。熒光顯微鏡與普通光鏡在結構上不同之處：（1）紫外光發生裝置：高壓汞燈+激發裝置+濾光裝置；（2）透鏡由石英玻璃制成，以便減少光通路上的紫外光損耗；（3）目鏡中要裝壓紫濾片Fluorescenceimageofepithelialcell,DNAinblueandMicrotubulesingreen用于觀察能激發出熒光的結構。用途：免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷。（三）相差顯微鏡原理：

光波的三個光學特性：（1）波長：對于光波波長變化，肉眼覺察為顏色變化;（2）振幅：對于光波振幅變化（即振幅差），肉眼覺察為明暗變化；（3）相位：指某一時刻，光在其前進路線上的位置。對于光相位的變化（即相位差），肉眼不能覺察。當光線穿過無色透明且非勻質的活細胞，其波長和振幅都無明顯變化，僅光相位出現一定程度變化。觀察時感覺反差較小，物體內部的結構難分辨。為何普通光鏡不適宜用于觀察活細胞？把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度。在構造上，相差顯微鏡的兩個特殊之處。環形光闌（annulardiaphragm）：位于光源與聚光器之間。作用：使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。相差板（annularphaseplate）：物鏡后加了涂有氟化鎂的相差板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。相差顯微鏡原理相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大，再經過光波干涉作用，使看不見的相位差轉變成可見的振幅差，從而反差增強，便能夠清晰看到被檢物體及其內部細微結構了。相差顯微鏡下的樣品不需染色，可以清晰觀察活細胞及其內部結構的變化。相差顯微鏡用途：觀察未經染色的玻片標本二、電子顯微鏡（一）透射電子顯微鏡transmissionelectronmicroscope,TEM不同光線的波長以電子束作光源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，并且波長與加速電壓(通常50~120KV)的平方根成反比。由電子束照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統等４部分構成。分辨率0.2nm，放大倍數可達百萬倍。用于觀察超微結構（ultrastructure），即小于0.2μm、光學顯微鏡下無法看清的結構，又稱亞顯微結構（submicroscopicstructures）。（1）照明光源不同。（2）放大倍數的調節方式不同。依靠改變磁透鏡的激磁電流強度來調節放大倍數。電流強度的變化引起了磁場強度的改變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程度發生改變，放大倍數隨之出現變化。（3）具有高壓穩壓系統。電子流的發射速度及波長皆取決于電壓的高低。透射電子顯微鏡特點（4）高度真空的工作系統。高速運動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞，就會改變它的發射方向，導致成像模糊。要求電鏡內的工作系統（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態，并且樣品都必須脫水。因此說，透射電鏡不能用來觀察活的樣品。透射電子顯微鏡特點（5）樣品厚度必須<900?（即90nm，0.09μm）。

電子穿透能力有限，樣品過厚則成像不清晰，并且高速穿透的電子會產生熱量，將厚樣品燒出白斑。透射電鏡觀察的樣品須超薄切片（400-500?），不能用普通光鏡下的組織切片（2-7μm）。

透射電子顯微鏡特點（6）標本染色技術不同。電鏡標本染色是使須觀察的結構與背景之間，黑白對比分明，反差強。染色劑大多是重金屬鹽類。染色方法有正染、負染兩類。正染：常采用醋酸鈾或檸檬酸鉛染色，使得被觀察的結構偏暗，背景較亮。負染：使用磷鎢酸染色，使得背景較暗，而觀察的結構顯得明亮突出。透射電子顯微鏡特點（7）特殊的投影技術（真空噴鍍法）。

對電鏡標本的表面處理技術，即以真空噴鍍儀在真空條件下，將金、鉑等金屬微粒傾斜地噴向標本，使其朝向發射源的表面所沉積的金屬微粒多于背面。電鏡觀察時感覺反差極強，具立體感。透射電子顯微鏡特點主要電鏡制樣技術1）超薄切片電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。超薄切片技術2）負染技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網上的樣品染色。吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方沒有染料沉積，從而出現負染效果。分辨率可達1.5nm左右。NegativeStainedActin主要電鏡制樣技術3）冰凍蝕刻

freeze-etching標本置于干冰或液氮中冰凍，然后斷開。升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。AYeastCell主要電鏡制樣技術20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結構。（二）掃描電子顯微鏡工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結構有關，次級電子由探測器收集，信號經放大用來調制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。掃描電子顯微鏡原理人類紅細胞酵母人類精子（三）掃描隧道顯微鏡

scanningtunnelingmicroscope，STM原理：根據隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態。分辨率：橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm。用途：三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察。掃描隧道顯微鏡原理一、離心技術分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。高速離心機:轉速為10~25kr/min。超速離心機:轉速>25kr/min。第二節細胞組分的分析方法（一）差速離心

Differentialcentrifugation特點：介質密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序細胞核——線粒體——溶酶體、過氧化物酶體——微體、高爾基體、囊泡——核蛋白體。細胞器初步分離后，再通過密度梯度離心純化。（一）差速離心

Differentialcentrifugation（二）密度梯度離心用介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。類型：速度沉降、等密度沉降。常用介質：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。1、速度沉降

velocitysedimentation

用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。特點：介質密度較低。原理：介質密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數以不同的速度沉降。2.等密度沉降

isopycnicsedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點：介質密度較高，陡度大。原理：樣品各成分在連續梯度的介質中，經過離心，沉降到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡。Velocity(A)andEquilibrium(B)sedimentation二、細胞成分的細胞化學顯示方法顯色劑能與待測物質中一些特殊基團特異性結合。通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺，判斷某種物質在細胞中的分布和相對含量。孚爾根反應：特異顯示DNAPAS反應：多糖米倫反應：蛋白質四氧化鋨、蘇丹紅：不飽和脂肪酸、脂滴格莫瑞法（Gomori）：堿性磷酸酶三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術：將免疫學方法（抗原—抗體特異結合）與熒光標記技術相結合，用于研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。四、細胞內特異核酸的定位與定性原位雜交（insituhybridization）：用標記的核酸探針，通過分子雜交，確定特異核苷酸序列在染色體上或在細胞中的位置的方法。標記探針方法1、放射性同位素標記（顯微放射自顯影）2、熒光素標記（熒光顯微鏡觀察）3、生物素標記五、流式細胞術用途：對單個細胞進行快速定量分析與分選。原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴；激光束的照射下，細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果。第三節細胞培養與細胞工程（一）群體培養和克隆培養群體培養（massculture）：將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單細胞層；克隆培養（clonalculture）：培養高度稀釋的細胞懸液，細胞貼壁生長，每個細胞形成一個細胞集落（克隆）。一、細胞培養（一）群體培養（左）和克隆培養（右）原代培養（primaryculture）：培養直接來自動物機體的細胞群。傳代培養（Passage）：將細胞從一個培養瓶轉移到另外一個培養瓶。傳代細胞：適應在體外培養條件下，持續傳代培養的細胞。（二）動物細胞培養Hela細胞（a)和CHO（b)細胞的培養細胞株（cellstrain）：從原代培養細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群。細胞系（cellline）：從腫瘤組織培養建立的細胞群或培養過程中發生突變或轉化的細胞，可無限繁殖。克隆（clone）：由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。（三）植物細胞培養外植體培養：誘導產生愈傷組織。研究植物的生長發育、分化和變異；無性繁殖；制取代謝產物。懸浮細胞培養：產業化大規模細胞培養，制取植物代謝產物。（三）植物細胞培養原生