醫療器械產品無菌和微生物限度檢查法主要內容微生物實驗室質量管理指導原則無菌檢查法微生物限度檢查法一二三一、微生物實驗室質量管理指導原則

（1）人員

（2）培養基（8）檢驗方法

（3）試劑（9）污染廢棄物的處理

（4）菌種（10）檢測結果的質量保證和檢測的質量控制

（5）環境（11）實驗記錄

（6）設備（12）結果的判斷和檢測報告

（7）樣品（13）文件用途：用于指導藥品微生物檢驗實驗室的質量控制實施要素（13個）一、微生物實驗室質量管理指導原則1.人員（1）檢驗人員要求具備微生物學或相近專業知識的教育背景必須熟悉相關檢測方法、程序、檢測目的和結果評價崗前培訓持續培訓 制定繼續教育計劃，保證知識與技能不斷的更新（2）管理人員要求專業技能和經驗水平應與他們的職責范圍相符如：管理技能、實驗室安全、試驗安排、預算、實驗研究、實驗結果的評估和數據偏差的調查、技術報告書寫等一、微生物實驗室質量管理指導原則培養基培養基的制備結塊顏色變化物理性狀明顯改變選擇質量符合要求適當條件下貯藏低溫干燥避光密封容器（尤其是盛放脫水培養基的容器）一、微生物實驗室質量管理指導原則培養基培養基的制備培養基制備過濾（如需要）分裝校正（25℃）±0.2溶化玻璃器皿純化水稱量加塞包扎脫水培養基記錄應達到相應的精確度自制培養基按配方準確配制按使用說明上的要求操作一、微生物實驗室質量管理指導原則培養基培養基的滅菌培養基應采用經驗證的滅菌程序滅菌商品化的成品培養基必須附有所用滅菌方法的資料培養基滅菌一般采用濕熱滅菌技術，特殊培養基可采用薄膜過濾除菌應確定每批培養基滅菌后的pH值一、微生物實驗室質量管理指導原則培養基培養基的貯藏自配的培養基應標記名稱、批號、配制日期、制備人等信息，并在已驗證的條件下貯藏商品化的成品培養基標簽上應標有名稱、批號、生產日期、失效期及培養基的有關特性，生產商和使用者應根據培養基使用說明書上的要求進行貯藏培養基滅菌后不得貯藏在髙壓滅菌器中，瓊脂培養基不得在0℃或

0℃以下存放瓊脂平板最好現配現用，如置冰箱保存，一般不超過1周，且密閉包裝一、微生物實驗室質量管理指導原則2.培養基培養基的質量控制試驗實驗室應制定試驗用培養基的質量控制程序，確保所用培養基質量符合相關檢査的需要實驗室配制或商品化的成品培養基的質量依賴于其制備過程，采用不適宜方法制備的培養基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響試驗結果的可靠性所有配制好的培養基均應進行質量控制試驗。實驗室配制的培養基的常規監控項目是pH值、適用性檢査試驗，定期的穩定性檢查以確定有效期除藥典附錄另有規定外，在實驗室中，若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養基且過程受控，那么同一批脫水培養基的適用性檢査試驗可只進行1次一、微生物實驗室質量管理指導原則3.試劑試劑試劑接收檢查貯藏關鍵試劑適應性文件化管理控制保存記錄相關資料標簽標明名稱制備依據適用性濃度貯藏條件制備日期有效期制備人等確保所用試劑質量符合相關要求一、微生物實驗室質量管理指導原則菌種概念和要求微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業派生菌株標準菌株：應來自認可的國內或國外菌種保藏機構標準貯備菌株：從國內或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經過復活并在適宜的培養基中生長后，即為標準貯備菌株一、微生物實驗室質量管理指導原則菌種概念和要求工作菌株標準儲備菌株用于制備每月或每周1次轉種的菌株工作菌株的傳代次數應嚴格控制，不得超過5代（從菌種保藏機構獲得的標準菌株為第0代，任何形式的轉種均被認為是傳代1次）必要時，實驗室應對工作菌株的特性和純度進行確認。常用菌種保藏方法：瓊脂斜面低溫保藏法、甘油冷凍管低溫保藏法、液氮超低溫保藏法。一、微生物實驗室質量管理指導原則菌種文件化規定（管理）與記錄建立和保存所有菌種的進出、收集、貯藏、確認試驗以及銷毀的記錄應有菌種管理的程序文件標準菌種的申購記錄從標準菌株到工作菌株操作及記錄定期轉種傳代，菌種純度、特性等實驗室所需關鍵指標確認的記錄每支菌種都應注明其名稱、標準號、接種日期、傳代數菌種生長的培養基和培養條件菌種保藏的位置和條件其他需要的程序一、微生物實驗室質量管理指導原則環境實驗室的布局和運行實驗室布局設計基本原則防止微生物的污染防止對人員和環境造成危害合理區分，避免混亂和污染，便利操作生物安全設計和建筑材料要求適用性：利于清潔、消毒、滅菌、減少污染的風險潔凈區應配獨立空氣機組或空氣凈化系統一、微生物實驗室質量管理指導原則潔凈室隔離系統生物安全控制區域實驗輔助室5.環境實驗室區

域無菌檢查室隔離系統或B+A單向流潔凈區域微限檢查室不低于D級環境下生物安全柜或B級單向流潔凈區域陽性間洗滌室實驗準備室培養基配制室實驗材料貯備室樣品接收室培養室試驗結果觀察區域菌種保藏室滅菌室污染物處理室一、微生物實驗室質量管理指導原則環境各潔凈級別懸浮粒子和環境微生物標準一、微生物實驗室質量管理指導原則5.環境潔凈實驗室的監測頻次及監測項目一、微生物實驗室質量管理指導原則環境文件化規定和記錄建立進出潔凈區域的人和物的控制程序和SOP并記錄建立潔凈度驗證及監測、消毒、清潔維護的程序和記錄微生物實驗室使用權限應限于經授權的工作人員一、微生物實驗室質量管理指導原則設備一般要求（1）微生物實驗室設備配備與檢驗能力和工作量相適應

類型、測量范圍和準確度等級應滿足檢驗所采用標準的要求（2）設備的安裝和布局便于操作易于維護易于清潔和校準保持清潔保持良好工作狀態（3）唯一標識用于試驗的每臺儀器、設備應該有唯一標識（4）儀器設備應有合格證書完成相應的檢定、校準、驗證、確認其性能，并形成相應的操作、維護和保養的標準操作規程后方可正式使用（5）儀器設備使用和日常監控要有記錄一、微生物實驗室質量管理指導原則樣品樣品采集隨機抽樣無菌抽樣抽樣消毒培訓人員 受控條件 防止污染無菌條件 無菌操作 環境監測不危害樣品中微生物

抽樣環境

應監測并記錄，同時還需記錄采樣時間

所抽樣品 清晰標識，避免樣品混淆和誤用一、微生物實驗室質量管理指導原則7.樣品樣品儲存和運輸待檢樣品應在合適的條件下貯藏并保證其完整性，盡量減少污染的微生物發生變化樣品在運輸過程中，應保持原有（規定）的儲存條件或采取必要的措施（如冷藏或冷凍）應明確規定和記錄樣品的貯藏和運輸條件一、微生物實驗室質量管理指導原則7.樣品樣品的確認和處理實驗室應有被檢樣品的傳遞、接收、儲存和識別管理程序收到樣品應盡快檢查，記錄被檢樣品所有相關信息樣品存在數量不足、包裝破損、標簽缺失、溫度不適等，實驗室應在決定是否檢測或拒絕接受樣品之前與相關人員溝通樣品的包裝和標簽有可能被嚴重污染，因此搬運和儲存樣品時應小心以避免污染的擴散，容器外部的消毒應不影響樣品的完整性選擇具有代表性的樣品，根據有關的國家或國際標準，或者使用經驗證的實驗方法，盡快進行檢驗實驗室應按照書面管理程序對樣品進行保留和處置。如果實驗用的是已知被污染的樣品，應該在丟棄前進行滅菌一、微生物實驗室質量管理指導原則8.檢驗方法檢驗方法選擇應根據檢驗目的選擇適宜的方法進行樣品檢驗檢驗方法的驗證藥典方法或標準中規定的方法是經過驗證的，當進行樣品檢驗時，應進行方法適用性確認如果不是藥典或標準中規定的方法，使用前應進行替代方法的驗證，確認其應用效果優于或等同于藥典方法替代方法的驗證按藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則（通則9201）進行一、微生物實驗室質量管理指導原則9.污染廢棄物處理污染廢棄物廢棄樣品過期（或失效）培養基有害廢棄物處理原則減少檢查環境和材料的污染符合國家環境和健康安全規定針對類似于帶菌培養物溢出的意外事件制定處理規程一、微生物實驗室質量管理指導原則檢測結果的質量保證和檢測的質量控制內部質量控制應制定對所承擔的工作進行連續評估的程序應定期對實驗環境的潔凈度、培養基的適用性、滅菌方法、菌株純度和活性(包括性能）、試劑的質量等進行監控并詳細記錄應定期對檢測人員進行技術考核應對重要的檢驗設備如自動化檢驗儀器等進行比對外部質量控制應參加與檢測范圍相關的國家能力驗證或實驗室之間的比對實驗來評估檢測水平，通過參加外部質量評估來評定檢測結果的偏差一、微生物實驗室質量管理指導原則11.實驗記錄所有關鍵的實驗細節實驗記錄數據完整原始記錄檢驗標準關鍵實驗設備記錄修改SOP實驗日期檢品名稱實驗人員姓名SOP編號或方法實驗結果偏差（存在時）實驗參數主管/復核人簽名現行有效應有記錄，設備日志或表格應設計合理，滿足試驗記錄的追蹤性，設備溫度必須記錄，且有追溯性。應指出如何進行正確的試驗操作記錄寫錯時，劃掉并簽字，原數據不能抹去或被覆蓋一、微生物實驗室質量管理指導原則結果的判斷和檢測報告實驗結果進行充分和全面的評價所有影響結果觀察的微生物條件和因素應完全考慮異常結果出現時，應進行偏差調查實驗室環境抽樣區的防護條件樣品在該檢驗條件下以往檢驗的情況樣品本身具有使微生物存活或繁殖的特性等情況回顧試驗過程，也可評價該實驗結果的可靠性及實驗過程是否恰當試驗操作被確認是引起實驗結果不符合的原因，那么應制定糾正和預防措施一、微生物實驗室質量管理指導原則12.結果的判斷和檢測報告樣品檢驗應有重試的程序微生物實驗室檢測報告應該符合檢測方法的要求實驗室應準確、清晰、明確和客觀地報告每一項或每一份檢測的結果一、微生物實驗室質量管理指導原則文件文件應當充分表明試驗是在實驗室里按可控的檢查法進行的一般包括人員培訓與資格確認設備驗收、驗證、檢定(或校準期間核查）和維修設備使用中的運行狀態(設備的關鍵參數）培養基制備、貯藏和質量控制菌種管理檢驗規程中的關鍵步驟數據記錄與結果計算的確認質量責任人對試驗報告的評估數據偏離的調查二、無菌檢查法概念無菌無任何存活微生物存在無菌檢查法用于檢查藥典要求無菌的藥品、生物制品、醫療器具、原料、敷料及其他品種是否無菌的一種方法如供試品無菌檢查符合規定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發現微生物污染性質：安全性、定性試驗特點：局限性二、無菌檢查法需符合無菌要求的產品有哪些？做什么？通則1107中的要求制劑通則、品種項下要求無菌的及標示無菌的制劑和原輔料用于手術、嚴重燒傷、嚴重創傷的局部給藥制劑標簽標示無菌的制劑用于止血并可被組織吸收的制劑要求無菌的醫療器械，包括外科用敷料，器材二、無菌檢查法需符合無菌要求的產品有哪些？做什么？二、無菌檢查法為什么無菌產品需符合無菌要求？為什么做？無菌產品污染微生物造成的危害微生物的生長繁殖，降低產品的有效性微生物的代謝產物（如一些霉素），可能危害使用者致病活微生物的存在，可能造成使用者再次感染二、無菌檢查法近些年來發生的藥害事件時間事件后果事件原因2006年7月“欣弗事件”致死11名患者未按批準的工藝參數滅菌，影響滅菌效果，導致微生物污染2008年10月“刺五加事件”3人死亡、3人嚴重不良反應流通環節被雨水浸泡，導致微生物污染二、無菌檢查法無菌產品的無菌檢查-怎么做？保證無菌檢查結果準確的要素：人、機、料、法、環各個環節的保證人員要求機：常用儀器：集菌儀、薄膜過濾裝置、冰箱、培養箱、顯微鏡、菌種鑒定儀等料：集菌培養器、濾膜、培養皿、玻璃器皿、試劑、生物指示劑、培養基、菌種方法：薄膜過濾法、直接接種法環境：無菌隔離系統或B+A硫乙醇酸鹽流體培養基（30~35

℃培養）金黃色葡萄球12mL培養基7支3種×2支/菌1支空白對照，不接菌3天內生長良好菌銅綠假單胞菌生孢梭菌胰酪大豆胨液體培養基（20~25

℃培養）枯草芽孢桿菌9mL培養基7支3種×2支/菌白色念珠菌1支空白對照，不接菌黑曲霉5天內生長良好接入小于100cfu的菌硫乙醇酸鹽流體培養基（FTM）胰酪大豆胨液體培養基（TSB）培養基適用性檢查靈敏度檢查（金葡、銅綠、生孢、枯草、白念、黑曲）無菌性檢查（5支，14天，應無菌）二、無菌檢查法培養基二、無菌檢查法如何開展無菌檢查實驗？查標準確定是否有具體的檢查方法有具體檢查方法無具體檢查方法方法確認方法適用性試驗確定無菌檢查方法二、無菌檢查法方法適用性試驗開展目的開展時間實驗菌種確認所采用的方法適合于供試品的無菌檢查。（確認供試品在該檢驗量、該檢驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不計）建立檢查法組分發生改變原檢驗條件改變大腸、金葡、枯草、生孢、白念、黑曲每種培養基的3個試驗菌株逐一進行適用性試驗，均應符合規定薄膜過濾法：取規定的樣品量過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入小于100cfu試驗菌，過濾。將相應培養基加入濾筒中。另取同體積培養基加入等量試驗菌，作為對照。培養時間不得超過5天。各菌同法操作直接接種法：取6管硫乙醇酸鹽流體培養基，接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管；取6管胰酪大豆胨液體培養基，接入小于100cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入規定量樣品，另1管作為對照。培養不超過5天二、無菌檢查法方法適用性試驗二、無菌檢查法供試品的無菌檢查關鍵理念無菌檢查法 包括薄膜過濾法和直接接種法只要供試品性質允許，應采用薄膜過濾法所采用的檢查方法和檢驗條件須與方法適用性試驗確認的方法相同無菌檢查中使用的表面活性劑、滅活劑、中和劑等，應證明其有效性和對微生物無毒性二、無菌檢查法供試品的無菌檢查檢驗數量指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量二、無菌檢查法供試品的無菌檢查檢驗量指供試品每個最小包裝接種至每份培養基的最小量（g

或

ml)表1、表2、表3中最小檢驗數量不包括陽性對照試驗用量二、無菌檢查法陽性對照和陰性對照陽性對照選擇①

無抑菌作用和抗革蘭陽性菌為主的供試品 金葡②

抗革蘭陰性菌為主的供試品 大腸③

抗厭氧菌的供試品 生孢④

抗真菌的供試品 白念⑤

陽性對照菌菌液制備同適用性試驗，加菌量為小于100cfu，陽性對照用供試品用量，同供試品無菌檢查時每份培養基接種的供試品量⑥

陽性對照容器72小時內應生長良好取相應溶劑的稀釋液、沖洗液同供試品操作，不得有菌生長陰性對照二、無菌檢查法接種培養基、培養及觀察一般樣品接種兩種培養基的支或瓶數相等。接種供試品體積不得大于培養基體積的10%FTM每管不得少于15mlTSB每管不得少于10ml供試品檢查時培養基用量和高度同方法適用性檢查FTM管置30~35℃，TSB管置20~25℃，培養14天，逐日觀察并記錄結果如在供試品加入后或培養過程中，培養基出現渾濁，14天培養后不能從外觀判斷有無微生物生長，可轉種同種新鮮培養基，培養3天，觀察是否再出現渾濁，或鏡檢判斷是否有菌二、無菌檢查法結果判斷合格結果無效不合格供試品管和陰性對照均澄清無菌生長，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，陽性對照管中陽性菌生長良好供試品管中任一管顯渾濁并確證有菌生長，陽性對照管中陽性菌生長良好，陰性對照均澄清無菌生長陽性、陰性及供試品管均澄清無菌生長。陰性對照長菌。樣品管長的菌非樣品本身的所用設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查要求回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染供試品管中生長的微生物經鑒定后，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）

無菌操作技術不當引起的試驗若經確認無效，應重試。重試時應重新取同量供試品試驗二、無菌檢查法判試驗結果無效的條件三、微生物限度法1.微生物計數法微生物計數法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數試驗環境應符合微生物限度檢查的要求（D+B）需氧菌總數：指胰酪大豆胨瓊脂培養基生長的總菌落數霉菌和酵母菌總數：指沙氏葡萄糖瓊脂培養基生長的總菌落數方法選擇原則：根據供試品理化特性和限度標準等因素選擇計數方法，所選方法的適用性須經確認三、微生物限度法計數方法1.微生物計數法平皿法 傾注法和涂布法薄膜過濾法最可能數法（MPN法）

用于微生物計數時精確度較差，僅在供試品需氧菌總數沒有適宜方法時使用，不適用于霉菌計數胰酪大豆胨瓊脂培養基（30～35℃銅綠假單胞菌接種量不大于100cfu，培養時間不超過3天金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌接種量不大于100cfu，培養時間不超過5天黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂培養基（20～25℃白色念珠菌接種量不大于100cfu，培養時間不超過5天黑曲霉與對照培養基比較，回收率在50％~200％之間））培養基：需氧菌總數：TSA霉菌及酵母菌總數：SDA培養基適用性檢查：TSA：銅綠、金葡、枯草、白念、黑曲SDA：白念、黑曲結果判定：

0.5-2三、微生物限度法1.微生物計數法三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查應進行方法適用性試驗，以確認所采用的方法適合于該產品的微生物計數試驗前評估根據配方進行分析，產品中是否有抑菌成分參照歷史上曾經進行過的方法驗證，根據歷史數據判斷產品是否有抑菌。通過預實驗判斷樣品中有無抑菌通過以上判斷，起草方法適用性試驗草案，確定方法適用性試驗具體過程。需氧菌計數用5種菌株試驗（銅綠、金葡、枯草、白念、黑曲）霉菌和酵母菌總數用2種菌株試驗（白念、黑曲）抑菌劑活性的去除和滅活（增加稀釋液或培養基體積、加入適宜的中和劑或滅活劑）三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查試驗組供試液中加入規定量的菌液供試品對照組供試液，不加菌液按照試驗組進行試驗菌液對照組取不含中和劑、滅活劑及表面活性劑的稀釋液加入規定量的菌液中和劑對照組中和劑、滅活劑及表面活性劑的稀釋液中加入規定量菌液結果判斷（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數比值應在0.5～2內（中和劑或滅活劑對照組的菌落數與菌液對照組菌落數比值應在0.5～2內三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液根據供試品的理化特性與生物學特性分裝5份，采取適宜的方法9.9ml制備合適的供試液。供試液+

0.1ml銅綠假單胞菌液<1>試驗組：稀釋度依據樣品特性，質量標準制定平皿法保證平皿中的菌數不大于100cfu三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查同試驗組用供試液不含中和劑、滅活劑及表面活性劑的的相應稀釋液分裝5份9.9ml稀釋液+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液<2>供試品對照組：供試品對照組為中國藥典特殊規定的，協調案無相關要求<3>菌液對照組：保證平皿中的菌數不大于100cfu平皿法三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查分裝5份9.9ml稀釋液+++++

0.10.10.10.10.1mlmlmlmlml金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液+

0.1ml金黃色葡萄球菌液+

0.1ml白色念珠菌液++

0.10.1mlml枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液++++

0.10.10.10.1mlmlmlml銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液+

0.1ml黑曲霉菌液+

0.1ml白色念珠菌液

+

0.1ml枯草芽孢桿菌液+

0.1ml銅綠假單胞菌液稀釋液90

ml稀釋液中和劑、抑菌劑或表面活性劑稀釋液<4>中和劑或滅活劑對照組：保證平皿中的菌數不大于100cfu平皿法三、微生物限度法1.微生物計數法-方法適用性檢查三、微生物限度法微生物計數法-供試品檢查檢驗量：一次試驗所用的供試品量（g、ml或cm2）隨機抽樣，不少于2個最小包裝，混合，取規定量供試品進行檢驗。除另有規定外，一般取10g或10ml供試品進行檢測，膜劑為100cm2；貴重藥品，微量包裝藥品的檢驗量可酌減；大蜜丸不得少于4丸，膜劑不得少于4片。計數按照計數方法適用性試驗確認的計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數的測定。供試品檢查時需進行陰性對照試驗。如果對照有菌生長，應進行偏差調查三、微生物限度法微生物計數法-供試品檢查培養試驗方式：按計數方法適用性試驗確認計數方法進行供試品中需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的測定培養條件：胰酪大豆胨瓊脂平板在30～35℃培養3-5天，沙氏葡萄糖瓊脂平板在20～25℃培養5～7天；MPN法和供試品接種，所有試驗管在30～35℃培養3～5天結果判斷-計數要求需氧菌總數是指胰酪大豆胨瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括真菌菌落數)霉菌及酵母菌總數是指沙氏葡萄糖瓊脂培養基上生長的總菌落數(包括細菌菌落數)若因沙氏葡萄糖瓊脂上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數結果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素(如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂中或選擇性培養基(如玫瑰紅鈉瓊脂培養基)，使用選擇性培養基時，應進行培養基適用性檢查若采用

MPN

法，測定結果為需氧菌總數結果判斷-計數標準各品種項下要求執行的微生物限度標準解釋如下：101cfu：

可接受的最大限度為20；102cfu：

可接受的最大限度為200；103cfu：

允許的最大限度為

2000：依此類推。若供試品的需氧菌總數、霉菌及酵母菌總數的檢查結果均符合該品種項下的規定，判供試品符合規定；若其中任何一項不符合該品種項下的規定，判供試品不符合規定。三、微生物限度法1.微生物計數法-供試品檢查系用于在規定的試驗條件下，檢査供試品中是否存在特定的微生物供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試三、微生物限度法2.控制菌檢查法在相應控制菌檢查規定的培養溫度及不短于規定的最長培養時間下培養，試驗菌應不得生長液體：與對照培養基管比較，被檢培養基管試驗菌應生長良好；固體：被檢培養基與對照培養基上生長的菌落大小、形態特征應一致。被檢培養基上試驗菌生長的菌落大小、形態特征、指示劑反應情況等應與對照培養基一致。促生長能力抑制能力指示能力培養基適用性試驗培養18h后觀察菌落形態三、微生物限度法2.控制菌檢查法三、微生物限度法2.控制菌檢查法培養基三、微生物限度法控制菌檢查法-方法適用性檢查試驗菌根據各品種項下微生物限度標準中規定檢查的控制菌選擇相應試驗菌株，確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，采取大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌方法按控制菌檢查法取規定量供試液及不大于100cfu的試驗菌接入規定的培養基中；采用薄膜過濾時，取規定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入規定的培養基或取出濾膜接入規定的培養基中

依相應的控制菌檢查方法，在規定的溫度及最短時間下培養，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征結果判斷若上述試驗檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性（《非無菌產品微生物檢查：微生物計數法》中的“抗菌活性的去除或滅活”）如果經過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對徹底的方法進行供試品的檢查陽性對照試驗

陽性對照試驗方法同供試品的控制菌檢查，對照菌的加量應不大于lOOcfu。陽性對照試驗應檢出相應的控制菌陰性對照試驗

以稀釋劑代替供試液按照相應控制菌檢查法檢查，陰性對照試驗應無菌生長。如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查耐膽鹽革蘭陰性菌預培養2h，20-25℃供試品至TSB制成1：10供試液腸道菌增菌液體30-35℃，24-48h相當于1g到腸道菌增菌液體紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂選擇性瓊脂30-35℃，18-24h供試液A供試液B

+菌測試菌株：大腸埃希菌銅綠假單胞菌定性試驗結果判斷：如果平板上無菌落生長，判供試品未檢出耐膽鹽格蘭陰性菌。三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查預培養2h，20-25℃供試品至TSB制成1：10供試液選擇性增菌30-35℃，24-48h腸道菌增菌液體0.1,0.01,0.001g選擇性瓊脂30-35℃，18-24h紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂供試液A供試液B

+菌定量試驗耐膽鹽革蘭陰性菌結果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，則對應培養管為陽性，否則為陰性。根據各培養管檢查結果，從表2查對1g或1ml供試品中含有耐膽鹽革蘭陰性菌的最大可能數。三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查增菌培養 30-35℃,18-24h結果判斷：若麥康凱瓊脂平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗,確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。相當于1g到TSB選擇性增菌，42℃，24-48h1mL到100mL麥康凱液體選擇性瓊脂30-35℃,18-72h麥康凱瓊脂供試液A供試液B

+菌大腸埃希菌三、微生物限度法2.控制菌檢查法-供試品檢查增菌培養30-35℃,18-24h10g到TSB選擇性增菌，30-35℃,18-24h0.1mL到

10mLRV沙門增菌液體選擇性瓊脂30-35℃,18-48h木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂供試液A供試液B

+菌沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上生長良好，菌落為紅色、中心有或無黑色。結果判斷：若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上有疑似菌落生長，且三糖鐵瓊脂培養基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層有黑色，應進一步進行適宜的鑒定試驗,確證是否為沙門菌。