第四篇

生物制品生產(chǎn)

第8講

動物細(xì)胞生物制藥第2節(jié)

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)1896192019872006為什么進(jìn)行動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)1962年開始動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)嘗試，目前已經(jīng)成為生物制藥的重要支撐技術(shù)。本講主要內(nèi)容1.適合大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞株2.動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器3.微載體及其培養(yǎng)特點(diǎn)4.動物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素與培養(yǎng)工藝

本講關(guān)鍵問題1.了解動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法2.了解適合動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器3.重點(diǎn)掌握微載體培養(yǎng)技術(shù)4.了解動物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素及灌注培養(yǎng)工藝第一部分細(xì)胞株與生物反應(yīng)器

一

適合大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞株（一）細(xì)胞系(Cell

line)

是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細(xì)

胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細(xì)胞群

體。第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞即稱之為細(xì)胞系。不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細(xì)胞系(Finite

cell

line)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細(xì)胞系

(Infinite

cell

line)。（二）細(xì)胞株(Cell

strain)是指從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離

培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)

胞群，稱細(xì)胞株。細(xì)胞株的建立需要從細(xì)胞系群體中分離出一個細(xì)胞，并使其在體外繁殖成為新細(xì)胞群體。毛細(xì)管法------形成單個細(xì)胞克隆的細(xì)胞群體有限稀釋法（三）適合工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞株根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，可以分為：1.原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞2.有限細(xì)胞系、無限細(xì)胞系（不具有接觸抑制現(xiàn)象；理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞）3.二倍體細(xì)胞、異倍體細(xì)胞4.融合細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞、基因工程細(xì)胞5.貼壁型、非貼壁型1.原代細(xì)胞雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞或鼠腎細(xì)胞、血液淋巴細(xì)胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎組織細(xì)胞生產(chǎn)

脊髓灰質(zhì)滅活疫苗，開創(chuàng)了動物細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行生物

制藥的先河。具有需要大量動物組織、成本高、費(fèi)時費(fèi)力等缺點(diǎn)。藥物篩選、藥理研究。2.傳代細(xì)胞二倍體細(xì)胞：具有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：二倍體染色體、

具有貼壁和接觸抑制特性、無致瘤性。

有限細(xì)胞

系（傳代次數(shù)一般都不超過50代）。WI-38：

1961年Wister

38研究所從女性高加索人的

正常胚肺組織中獲得的一株人2倍體細(xì)胞系WI-38。

培增時間24h；貼壁生長；第一批獲得批準(zhǔn)用于生

產(chǎn)的二倍體細(xì)胞有對病毒敏感，第一個用于疫苗

（脊髓灰質(zhì)滅活疫苗）生產(chǎn)。MRC-5：二倍體，成纖維，生長比WI-38快。3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞：正常細(xì)胞由于受到病毒或其他促癌因子

的誘導(dǎo)而變成了具有癌細(xì)胞屬性的細(xì)胞。特點(diǎn)如

下：無限增殖能力密度抑制喪失血清依賴性降低形態(tài)學(xué)改變：可懸浮生長核型改變：非整倍體細(xì)胞膜功能改變：運(yùn)輸能力增加、對化學(xué)致癌物抵抗力增加

致瘤性轉(zhuǎn)化細(xì)胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。

一般轉(zhuǎn)化細(xì)胞并不致瘤。致瘤性評價：接種到動物體內(nèi)，發(fā)展形成腫瘤結(jié)

節(jié)，為生瘤陽性。隨著對腫瘤發(fā)生機(jī)制等研究的深入，轉(zhuǎn)化細(xì)胞于20

世紀(jì)80年代獲得批準(zhǔn)用于生產(chǎn)。

轉(zhuǎn)化方法（1）細(xì)胞自轉(zhuǎn)化細(xì)胞體外培養(yǎng)時，由于環(huán)境因子因素的影響，有時會發(fā)

生自發(fā)轉(zhuǎn)化，由原來的二倍體核型變成多倍體/異倍

體核型，而獲得永生化，失去接觸抑制，可無限繁殖

傳代。可能的因素包括：血清質(zhì)量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污

染等，均有可能失去正常細(xì)胞特性，而發(fā)生遺傳變異

甚至發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此為了維持二倍體細(xì)胞的正常細(xì)胞

特性，防止遺傳變異和轉(zhuǎn)化，應(yīng)盡量早期凍存和減少

傳代。（2）人工誘發(fā)轉(zhuǎn)化1）誘發(fā)采用誘導(dǎo)劑使正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。物理因素：如放射線、溫度、電磁波、藥物等化學(xué)因素：如甲基膽蒽、土醌80、7，12-二

甲基苯醌

（DMBA）、3-甲基膽蒽、甲基甲磺醌（MMS）、乙基

亞硝基脲（ENC），甲基硝基亞硝基胍類化合物

（MNNG）等。生物因素：如毒素、黃曲

霉毒素、病毒SV40、EB病毒、多發(fā)瘤病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。2）細(xì)胞系篩選誘變劑（致癌物）處理后的細(xì)胞群中進(jìn)入轉(zhuǎn)化發(fā)展階段

的細(xì)胞僅是一小部分（大約5%），這些細(xì)胞稱為癌前

細(xì)胞。癌前細(xì)胞由于失去了接觸抑制，加上生長繁殖速度變快

，在局部癌前細(xì)胞的數(shù)量增多而堆積，最后形成了明

顯

可見的“轉(zhuǎn)化灶”。“轉(zhuǎn)化灶”進(jìn)行克隆分離和純化后，

繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，

即可形成穩(wěn)定的傳代細(xì)胞系。比二倍體減少1條(2n-1)或幾條染色體的細(xì)胞稱亞二倍體

常用細(xì)胞株CHO細(xì)胞(Chinese

hamster

ovary

cell)：從中國倉鼠卵巢

分離的細(xì)胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長，也

可以懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能

力。CHO細(xì)胞能表達(dá)糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活

劑(Tissue

plasminogen

activator，tPA)、促紅細(xì)胞生

成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原

（Hepatitis

B

virus

surface

antigen,

HBsAg）、粒

細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte

colony

stimulating

factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。BHK-21細(xì)胞（Baby

hamster

kidney

cell）：是1961年英國從幼地鼠的腎臟分離的細(xì)胞。成纖維樣，異倍體。常用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白(例如重組凝血因子VIII)。Vero細(xì)胞（Vero

cell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細(xì)胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動物細(xì)胞之一。

（4）融合細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞：脾臟B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞。無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長。抗體藥物生產(chǎn)。二

動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)（一）定義動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)（cell

large-

scale

culture）：是指在人工條

件下（設(shè)定pH、溫度、溶氧等）

高密度大量增值的技術(shù)。培養(yǎng)流程：組織—消化—原代培養(yǎng)—傳代培養(yǎng)

（細(xì)胞系與細(xì)胞株）—小規(guī)模培

養(yǎng)（轉(zhuǎn)瓶等）—大規(guī)模培養(yǎng)（生

物反應(yīng)器）—產(chǎn)品（二）轉(zhuǎn)管/瓶培養(yǎng)系統(tǒng)

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)基礎(chǔ)上為擴(kuò)大培養(yǎng)量而改進(jìn)的。轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管固定在旋轉(zhuǎn)支架上，傾斜角度一般為5o-10o。細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動，細(xì)胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。（三）動物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)

除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)原則應(yīng)該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。

由于動物細(xì)胞生長的特殊性，如貼壁、脆弱等，與微生物細(xì)胞培養(yǎng)不同，需要特別注意反應(yīng)器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及特殊載體的選擇。問題：1.如何設(shè)計(jì)生物反應(yīng)器，降低動物細(xì)胞培養(yǎng)的剪切力損傷？2.如何滿足細(xì)胞貼壁要求又能充分利用反應(yīng)器空間體積？

1.動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器機(jī)械攪拌式：漿葉改造充氣攪拌式：需要改造微載體培養(yǎng)：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培養(yǎng)中空纖維式：解決貼壁、營養(yǎng)氣體有效吸收交換、

連續(xù)灌注培養(yǎng)

氣泡用絲網(wǎng)隔開，不與細(xì)胞直接接觸。反應(yīng)器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力，以滿足細(xì)胞生長的要求。籠式鼓氣生物反應(yīng)器這種類型的生物反應(yīng)器攪拌速度一般都非低，盡量減少剪切力對細(xì)胞的影響。機(jī)械攪拌結(jié)合鼓氣的生物反應(yīng)器一次性培養(yǎng)袋在線分析技術(shù)中空纖維是一種細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜。主體是由微孔中空纖維管束制成的中空絲，纖維束由外殼包裹，因此可分為中空內(nèi)腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進(jìn)出口。新鮮培養(yǎng)液從中空內(nèi)腔導(dǎo)入。氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地?cái)U(kuò)散至殼體內(nèi)部。中空纖維生物反應(yīng)器柱式中空纖維生物反應(yīng)器板框式中心灌流式特點(diǎn)模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)。

既可用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)。細(xì)胞如果是附壁性的，則附著在纖維外殼表面，在培養(yǎng)結(jié)束后用胰蛋白酶消化液將其消化沖出；若是非附壁性的，應(yīng)采用微濾材料將其截留在反應(yīng)器內(nèi)而讓培養(yǎng)液排出。優(yōu)點(diǎn)：無剪切力影響，高密度培養(yǎng)，傳質(zhì)效率高。缺點(diǎn)：容易堵塞，價錢昂貴。小結(jié)1.動物細(xì)胞生物制藥常用的細(xì)胞株2.動物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器：傳統(tǒng)反應(yīng)器改造、

中空纖維反應(yīng)器補(bǔ)充文獻(xiàn)：第二部分微載體培養(yǎng)與動物細(xì)胞培養(yǎng)影響因素（一）微載體培養(yǎng)技術(shù)微載體（Microcarrier）：是直徑60-250μm的適用

于貼壁依賴型細(xì)胞生長的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。1967年，維茨爾（Van

Wezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。微載體系統(tǒng)將傳統(tǒng)的一維平面貼附擴(kuò)展為三維立

體貼附，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制。

同時，微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動物細(xì)胞

大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足動物細(xì)胞的貼

壁要求，又能充分利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間。微載體特點(diǎn)1.好的生物相容性：無毒無害，有好的黏附性，一般帶正電荷2.大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一3.良好的傳質(zhì)性能4.強(qiáng)的機(jī)械性能：重復(fù)利用、保護(hù)細(xì)胞5.好的熱穩(wěn)定性：高壓滅菌

制備微載體的材料1.人工合成聚合物聚甲基丙烯酸-2

羥乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。2.天然聚合物及其衍生物明膠、膠原、纖維素、甲殼質(zhì)及其衍生物、海藻酸鹽功能材料2004，35卷，增刊微載體分類1.實(shí)心微載體優(yōu)點(diǎn)：易于細(xì)胞在表面貼壁，機(jī)械強(qiáng)度高，容易接種操作缺點(diǎn)：細(xì)胞濃度低；細(xì)胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響；細(xì)胞易老化脫落。2.多孔微載體優(yōu)點(diǎn)：比表面積更大，使細(xì)胞免受機(jī)械損傷，得到的細(xì)胞濃度高，可降低血清用量，可以采用高的攪拌速度和通氣量缺點(diǎn)：容易產(chǎn)生營養(yǎng)傳遞障礙，積聚代謝副產(chǎn)物。

（1）微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞經(jīng)黏附貼壁、生長和擴(kuò)展成單層

三個階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微

載體表面的貼附是關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載

體表面黏附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概

率和親和性，也與培養(yǎng)基組成、攪拌等相關(guān)。

影響貼壁的因素貼壁主要是靠靜電引力和范德華力。取決于細(xì)胞與

微載體表面理化性質(zhì)和微載體接觸概率有關(guān)。電荷：一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時，表面帶負(fù)電荷。

若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞

貼壁速度。培養(yǎng)基組分：添加血清有助于細(xì)胞貼壁。提供促接觸和伸展因子。攪拌：不能僅依靠大的攪拌速率保證接觸概率。在

貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時攪時停；數(shù)小時后，

待細(xì)胞附著于微載體表面時，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)

速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，

最大速度75r/min。其它因素：培養(yǎng)基偏酸或偏堿、微載體不潔等不利條件都不利于細(xì)胞貼壁。一種微載體產(chǎn)品（Fibra-Cel）人胚腎細(xì)胞HEK293人上皮細(xì)胞——SoloHill微載體上的生長微載體對細(xì)胞生長具有顯著的影響問題：微載體培養(yǎng)如何收獲細(xì)胞？接種細(xì)胞傳代呢？胰蛋白酶消化將貼滿細(xì)胞的微載體與新鮮微載體混合，實(shí)現(xiàn)細(xì)

胞因隨機(jī)碰撞而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移貼附在新載體表面的技

術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：（1）避免了細(xì)胞收獲與微載體再生過程，方便、高效。（2）防止細(xì)胞調(diào)亡：通過定期更換微載體也能為細(xì)

胞的分裂生長提供了新的生長空間，在長期培養(yǎng)

過程中保持細(xì)胞活力，延長了細(xì)胞壽命，提高了

細(xì)胞分泌物的產(chǎn)量。球傳球(bead

to

bead)技術(shù)優(yōu)點(diǎn)1.模擬了體內(nèi)三維生長環(huán)境，減輕了接觸抑制，可以多層生長。2.很好地解決了生物反應(yīng)器的空間分布問題，單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小；勞動強(qiáng)度小；放大容易，使大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞成為可能。3.把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；可以稍加改造利用傳統(tǒng)生物反應(yīng)器。4.接種與收獲方便；可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率較高。（二）動物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素1.細(xì)胞凋亡（1）有毒物質(zhì)或抑制因子產(chǎn)生氨：來自培養(yǎng)基+代謝，積聚影響細(xì)胞生長。乳酸：來自細(xì)胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑制糖酵解，能量產(chǎn)生減少，抑制細(xì)胞生長。甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞有潛在的損傷作用。（2）營養(yǎng)成分耗盡如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細(xì)胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中