ICS07.100.30C53中華人民共和國國家標準GB/T：19915.4—2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法MethodofdetectingStreptococcussuistype2bytriple-PCR2005-09-27發布2005-11-01實施中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局發布中國國家標準化管理委員會

GB/T19915.4—2005豬鏈球菌2型是鏈球菌屬的成員，其致病菌株可致豬鏈球菌病,引起豬敗血癥、腦膜炎等。人可通過傷口感染該苗.并導致死亡。為了區別正常豬所攜帶的豬鏈球菌2型無毒苗林與發病豬分離的致病菌林，特制定本標準。本標準是采用現代分子生物學診斷技術制定的。本標準由農業部畜牧獸醫局提出。本標準由全國動物防疫標準化技術委員會歸口本標準起草單位：南京農業大學。本標準主要起草人：陸承平、姚火春、范紅結、何孔旺、

GB/T19915.4—2005豬鏈球菌2型三重PCR檢測方法范圍本標準規定了豬鏈球菌2型英膜基因(cp.2）、溶菌酶釋放蛋白基因(mrp)和or/2這三個毒力基因的三重PCR檢測技術。本標準適用于由豬鏈球菌2型致病基因和致病菌株的檢測范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件.其隨后所有的修改單(不包括勒誤的內容)或修訂版均不適用于本標準.然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T6682—1992分析實驗室用水規格和試驗方法3術語和定義下列術語和定義適用于本標準豬鏈球菌2型Sirepiococcussuistype2豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細菌,根據其英膜多糖抗原的差異,可分為1～34及1/2共35個血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個血清型,不僅對豬致病性很強，而且可以感染特定的人群.是一種重要的人畜共患病病原菌。側定方法4.1方法提要挑取可疑細菌培養物菌落，加入PCR反應管中,進行PCR擴增.瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物.與標準分子量標記比較，來確定擴增產物的大小。4.2試劑和材料除另有規定,所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-1992的滅菌雙蒸水。4.2.1CDs2、"rp和or/2的上下游引物，按合成說明書使用。4.2.2TagDNA聚合酶。4.2.3瓊脂糖：電泳級。4.2.4溴化乙鍵。4.2.5分子量標記：DL-2000.4.2.6TE緩沖液：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)4.2.710×PCR緩沖液：100mmol/L.KCl,160mmol/L（NH,)SO,,20mmol/LMgSO,,200mmol/LTris-HCl(pH8.8).1%TritonX-100,1mg/mLBSA4.2.8電泳緩沖液：242gTris堿，57.1mL冰乙酸,100mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)，加蒸水至1000mL.使用時10倍稀釋。4.2.9加樣緩沖液:0.25%溴酚藍.40%蔗糖4.2.10陽性對照豬鏈球