《生化實驗技術》第一講核酸化學實驗技術第二講蛋白質化學實驗技術第三講酶學實驗技術第四講糖類化學實驗技術第五講脂類化學實驗技術第六講維生素和輔酶化學實驗技術實驗授課內容課堂理論：課前輔導生化大分子基本性質、提取、分離純化、含量檢測等相關生化物質的分離分析技術。項目任務：設計案例，引導學生去解決案例問題的方式向學生布置項目任務、實驗設計和實施要求。實驗設計：學生分組——查閱資料——設計實驗方案——網上遞交——教師修改及審核——大組討論評價實驗操作：各小組（2人）為單位進行實驗試劑、器材的準備，按實驗設計完成實驗內容操作。實驗論文：根據任務要求，每位學生獨立完成課程論文。課堂討論：大組為單位進行全班ppt形式交流匯報實驗實施流程課程內容學時綜合訓練內容理論輔導與實驗設計評價2實驗設計要求，DNA提取與鑒定技術，案例引導，項目任務發布；學生設計方案評價交流實驗1基因組DNA的提取與PCR鑒定16基因組DNA提取DNA含量和純度測定DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR及產物檢測課堂研討2實驗過程總結，實驗成果、創新技術分享，教師點評和總結

第一講核酸化學實驗技術案例1目前，人們的生活中充斥了越來越多的轉基因產品，如轉基因大豆、轉基因棉花、轉基因玉米、馬鈴薯、水稻等等。轉基因作為一種新興的生物技術手段，它的不成熟和不確定性，使得轉基因食品的安全性成為人們關注的焦點。

問題：如何檢測轉基因食品？第一節實驗項目發布與設計方案評價什么是轉基因食品？轉基因食品：以轉基因生物為直接食品或為原料加工生產的食品。轉基因食品利用現代分子生物技術，將某些生物的基因轉移到其他物種中去，改造生物的遺傳物質，使其在形狀、營養品質、消費品質等方面向人們所需要的目標轉變。

轉基因育種的程序？標記基因啟動子外源目的基因終止序列載體的構建轉基因食品的核酸檢測技術檢測對象：轉基因的啟動子、終止子、抗性篩選基因、目的基因等外源基因檢測方法：普通定性PCR、實時熒光定量PCR、基因芯片其中以普通定性PCR、實時熒光定量PCR最常用。核酸定性PCR法檢測轉基因食品樣品基因組DNA的提取DNA提取質量檢測特有序列的PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物進一步驗證：測序、PCR產物酶切鑒定、實時熒光定量PCR方法等一般步驟核酸定性PCR法檢測轉基因食品案例2某實驗人員從土壤中分離篩選出一株產植酸酶的菌株，經形態學和生理生化特性初步鑒定為真菌。真菌種類繁多，地球上大約存在150萬種真菌，已經被發現和運用的大約有69000種。

生物遺傳物質攜帶了物種的特異信息，在屬種間具有高度的保守性。因此，可應用分子生物學鑒定手段對真菌進行種類鑒定和系統分類。

問題：如何準確鑒定其種屬？圖1真菌rDNA轉錄區和相關引物真核生物基因組中編碼核糖體的基因包括28S、5S、18S和5.8SrDNA4種，在染色體上頭尾相連，串聯排列，相互間由間隔區分隔。18S、5.8S和28SrDNA基因組成一個轉錄單元（圖1），三者高度保守，適合較高等級水平生物群體間的系統分析。其間的間隔區為內轉錄間隔區（InternalTranscribedSpacer，ITS），包括ITS1和ITS2，進化相對迅速，具有多態性，適合較低等級水平的系統學研究。18SrDNA5.8SrDNA28SrDNA53ITS1ITS2ITS1primerITS2primerITS3primerITS4primer設計特定引物對該真菌菌株中的基因組中的rDNA轉錄區的特定核苷酸片段進行PCR擴增，通過對所獲得的PCR產物進行測序分析，與已知真菌序列比對即可確定該菌株在系統分類學上的位置。基于rDNA-ITS序列在真菌分子鑒定中的應用，你如何獲得高質量的基因組DNA并鑒定菌株的目的基因序列？

PrimerSequence（5’-3’）Length(bp)ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG19ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC20ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC20ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC20表1真菌rDNA-ITS通用擴增引物18SrDNA5.8SrDNA28SrDNA53ITS1ITS2ITS1primerITS2primerITS3primerITS4primer圖1真菌rDNA轉錄區和相關引物真菌rDNA-ITS通用引物實驗設計要求：根據案例提交一個具體解決基因組提取及分離鑒定的實驗設計方案，包括從提供的不同材料中提取、分離得到基因組DNA，測定所得DNA的含量、純度及分子大小，并利用已知引物進行PCR擴增，分析PCR檢測的結果。

實驗題目：

基因組DNA的提取與PCR鑒定實驗項目與任務布置分組題目項目1：定性PCR法檢測轉基因食品項目2：rDNA-ITS擴增法鑒定真菌種類全班分成4大組，各選一個題目。每個大組3個小組，2名同學一個小組。以大組為單位進行實驗準備和討論。以小組為單位進行實驗設計和操作。實驗目標學習從各種材料（動物、植物組織、微生物）中提取和純化DNA的原理和操作技術。

學習水平式瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測，確定DNA的純度、含量與分子大小。學習PCR的基本原理和操作方法。掌握高速冷凍離心機、微量移液槍、水平電泳儀、PCR儀等儀器設備的使用。實驗設計需包含的主要技術內容基因組DNA提取：可選用濃鹽法、陰離子去污劑法、苯酚抽提法、水抽提法、試劑盒法等DNA含量測定：可選用二苯胺法、紫外分光光度法等DNA純度測定：紫外分光光度法DNA分子大小測定：瓊脂糖凝膠電泳PCR技術實驗結果要求各標準曲線基因組DNA產品得率（mg/100g)基因組DNA產品純度基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖PCR產物分子大小（bp）檢測結論基因組DNA提取4學時DNA的含量與純度測定4學時DNA的瓊脂糖凝膠電泳4學時PCR及產物檢測4學時實驗時間安排課后研討題1.DNA提取的方法主要有哪些？并說明各方法的原理。2.結合本人實驗操作的體會，試述在提取過程中應如何避免大分子DNA的降解和斷裂？3.查閱資料，說明提取的基因組DNA有哪些方面的用途？4.查閱資料，舉例說明DNA瓊脂糖凝膠電泳的應用和發展。5.瓊脂糖凝膠電泳所用DNA染料EB具有潛在的致癌性，查閱資料，查找可替代EB的染料并說明優缺點。課后研討題6.結合本次實驗，說明PCR技術的主要用途和發展。7.通過本次實驗，談談你對轉基因食品安全性的認識。8.查閱資料，說明轉基因食品檢測的常規方法。9.查閱資料，綜述常用的物種分子鑒定技術。10.案例分析：在美國海豹突擊隊擊斃本拉登幾個小時后，美國總統奧巴馬向全世界宣布拉登已被成功擊斃，死者確定為本拉登的可能性是99.9%。查閱資料，根據所學核酸分子鑒定技術，分析如何對其進行法醫鑒定。

相關事項實驗習慣

——藥品配制與保存實驗記錄實驗交流實驗論文GoodLuck！材料名稱份數分值實驗設計方案115%實驗記錄110%實驗論文250%課后研討題210%匯報ppt115%小組上交材料論文格式模板研討課要求以大組為單位課后總結結果，討論，制作一份ppt，課內討論匯報。ppt內容包括：實驗背景和目的，實驗主要原理，實驗條件的選擇，各小組實驗結果和分析，課后研討題，實驗體會等。

基因組是指細胞內遺傳信息的攜帶者DNA的總體。為了研究DNA分子在生命代謝中的作用，常常需要從不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物體內的分布及含量不同，要選擇適當的材料提取DNA。從各種材料中提取DNA方法不同，分離提取的難易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于細胞核中，與蛋白質結合構成染色體，原核生物的DNA不與任何蛋白質結合。理論介紹一、內容提要保持基因組DNA結構相對完整：防止各種因素引起的降解。純度高：盡量排除其他大分子成分的污染（蛋白質、多糖和RNA等）。得率好：選用合適的方法獲得足夠量的DNA。二、分離純化核酸的總原則三、基因組DNA提取的原理和方法裂解細胞，釋放DNA核酸分離純化沉淀并吸附核酸核酸溶解（緩沖液）準備適宜的材料去除蛋白質、RNA等雜質細胞破碎細菌—溶菌酶（降解細胞壁），EDTA（抑制DNA酶，防止DNA降解），去垢劑SDS（破壞細胞膜）酵母—破壁酶或液氮研磨植物材料—液氮研磨（使細胞凍結，用研缽碾制成粉狀）動物組織—勻漿或液氮研磨化學法、機械法、生物法DNA與蛋白質的分離SDS：真核生物的DNA與組蛋白結合形成DNP，SDS能夠破壞DNA與蛋白質之間的靜電引力或配位鍵，可使DNA與蛋白質解聚，釋放出DNA。CTAB：是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，能與核酸形成復合物，在高鹽溶液（NaCl>0.7M）中是可溶的，當NaCl降低到0.3M時，可沉淀CTAB-核酸復合物。苯酚-氯仿-異戊醇：苯酚、氯仿能變性蛋白質，離心分層，DNA溶于上層水相，變性蛋白質位于水相和有機相之間。異戊醇可減少抽提過程的泡沫產生。1.DNP中DNA與蛋白質的分離2.蛋白質的去除核酸分離純化RNA的去除用不含DNA酶的RNase處理，使RNA降解。添加RNase處理后，可再用等量的苯酚/氯仿抽提，離心除去蛋白質及寡核苷酸。核酸分離純化含DNA的水相可用1倍體積的異丙醇或2倍體積的無水乙醇沉淀。基因組的大分子DNA沉淀形成纖維狀絮團漂浮其中，可用吸頭將其挑出，而小分子DNA則只形成顆粒狀沉淀附在壁上及底部。如果DNA沉淀量少或無法撈出，可離心獲取沉淀。沉淀DNA前，為提高沉淀效果，可加入NaAC、乙酸銨等鹽類促進沉淀。獲取的沉淀需再用70%乙醇洗滌除去殘留的有機物、無機鹽等。沉淀并吸附核酸基因組DNA提取注意事項使用新鮮、幼嫩的材料；材料應適量，過少造成核酸提取量少，過多影響裂解，導致DNA量少。（推薦0.2-5g）。簡化操作步驟，縮短提取過程，避免物理、化學和生物的因素對核酸的降解，如機械剪切力、高溫和DNase等酶，防止過酸、過堿，避免劇烈振蕩和混合。采用酚-氯仿抽提時應采用上下顛倒的方法充分混勻，但動作要輕柔，離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間。沉淀DNA用的異戊醇、乙醇事先放入-20℃冰箱，待用時取出。特別注意液氮研磨時為防止凍傷，需戴棉線手套操作，研磨越細越好。苯酚腐蝕性極強，并可引起嚴重灼傷，操作時應戴手套。一定要搞清提取原理，知道每一步操作DNA所在的位置，防止出錯。四、基因組DNA的檢測1、二苯胺顯色法測定DNA濃度二苯胺法定量測定DNA的原理為：在強酸、加熱條件下，可以使DNA中的嘌呤堿基與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，產生嘌呤堿基、脫氧核糖與嘧啶核苷酸。其中，2’-脫氧核糖在酸性環境中成為w-羥基-r-酮基戊醛，此物與二苯胺反應生成藍色化合物，在595nm處有最大吸收。DNA在40-400ug范圍內光吸收值與DNA含量成正比。

詳見教材：實驗二十二二苯胺顯色法測定DNA濃度2、紫外分光光度法測定DNA含量核酸、核苷酸及其衍生物都具有共軛雙鍵，具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰為260nm。一般在260nm波長下，在pH7.0時每毫升含1μgDNA溶液的光吸收值約為0.020。故測定待測DNA溶液260nm的光吸收值即可計算出其中核酸的含量。此法操作簡便，迅速。詳見實驗課件：核酸定量測定3、紫外分光光度法測定DNA純度

當DNA樣品中含有蛋白質、酚或其他小分子污染物時，會影響DNA吸光度的準確測定。DNA純度的判斷根據OD260/OD280值判斷，符合要求、純度高的純化DNA其比值為1.8。如果樣品中污染有蛋白質或酚，其OD260/OD280將明顯低于此值。此時無法對樣品中的核酸進行精確定量。4、瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA分子大小

電泳是荷電溶質或粒子在電場作用下發生定向泳動的現象。核酸的分離和鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳。不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電