結核感染T細胞斑點檢測試劑盒（免疫斑點法）上海復星一、背景公司成立于2003年，依托牛津大學科研技術開發新產品基于T細胞檢測的技術平臺最先獲得認可產品：T-SPOT?.TB在歐洲、美國、加拿大和其它地區正式上市OxfordImmunotec公司簡介Above:UKheadquartersAbingdon,OxonBelow:USheadquarters,Marlborough,MA結核病——全球關注的問題全球20億人口感染結核新增活動性結核病人約900萬/年每年130萬患者死亡中國450萬活動性結核病人新增活動性結核病人約145萬/年死亡人數約13萬/年試劑盒研制臨床背景活動性結核與潛伏感染接觸活動性結核病患者暴露程度不足，結核桿菌被機體免疫力清除沒有癥狀,結核桿菌仍舊存在而不能被偵測

X-光/CT掃描顯示正常沒有抗體應答診斷困難傳統的結核感染檢測只有TST（PPD）機體被感染受機體免疫力抑制沒有臨床癥狀終身處于感染狀態潛伏感染有臨床癥狀具有傳染性結核桿菌可以通過涂片、培養檢測出胸部的X-光或CT掃描顯示異常

肺外結核難以診斷(特別是兒童)活動性結核5%5%再次激活控制結核的關鍵早發現早治療二、方法原理γ-干擾素釋放實驗（IGRAs，interferon-gammareleaseassays）酶聯免疫斑點技術（ELISPOT，Enzyme-LinkedImmunoSpotassay）結核桿菌特異抗原早期抗原靶6（ESAT-6，earlysecretedantigenictarget6）培養濾液蛋白10（CFP10，culturefiltrateprotein10）試劑盒研制技術背景γ-干擾素釋放實驗（IGRAs）TB抗原多肽T細胞活化T細胞γ干擾素γ干擾素檢測陰性γ干擾素檢測陽性結核感染者體內存在特異的效應T淋巴細胞，效應T淋巴細胞再次受到結核抗原刺激時會分泌多種細胞因子（IFN-γ）。因此，檢測效應T淋巴細胞可用于結核病或結核潛伏感染者的診斷。由于效應T細胞存活時間很短，而且具有特異性，因此可以作為機體是否正處于被感染的指標，無論是否有臨床癥狀?；贗GRAs原理的產品目前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等國家寫入本國的結核診療指南中γ-干擾素釋放實驗（IGRAs）1983年，在南北兩個半球地理位置相距遙遠的兩個研究小組幾乎同時、獨立地創立了這項技術。一個研究小組位于澳大利亞西部的柏斯Peth，牽頭人是當時正在當地Margaret女王醫院兒童醫學研究所攻讀博士學位的JonathonD.Sedgwich（SedgwickJDet.al.,1983）。另一個研究小組位于北歐瑞典城市哥德堡Gothenburg，帶頭人是哥德堡大學醫學微生物系的學者CecilC.Czerkinsky

（CzerkinskyCCet.al.,1983a）。酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）近二十多年來，隨著抗體制備、PVDF膜材料等技術改良，ELISPOT分析技術已經是當世公認的最靈敏的抗原特定T細胞的體外檢測技術結合了細胞培養技術與酶聯免疫吸附技術，能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況，靈敏度高。其技術原理，可一句話概括為：用抗體捕獲培養中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯斑點顯色方式將其表現出來（SedgwickJD2005）。酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）酶聯免疫斑點技術（ELISPOT）由結核桿菌基因組RD1區相同的操縱子編碼的蛋白所有的卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數的環境分枝桿菌也不存在RD1區結核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP10抗原采用γ-干擾素釋放實驗原理，依靠結核特異抗原保證效應T淋巴細胞的特異性結合酶聯免疫斑點技術的特性，提高檢測靈敏度三、試劑及檢測過程試劑盒主要原材料研究試劑盒主要組成成分結核桿菌特異抗原（ESAT-6、CFP10）植物血凝素（PHA）對照抗原預包被的培養板、標記二抗、底物顯色液國外上市情況2004年-英國MHRA認證和歐盟CE認證（EU）2005年-加拿大上市許可2006年-韓國上市許可2008年-美國FDA的PMA認證2010年-中國、新加坡和俄羅斯的產品注冊

試劑盒國外上市及應用情況采集樣本（外周抗凝全血）密度梯度離心分離外周血單個核細胞（PBMCs）洗滌PBMCs檢測過程把PBMCs與結核特異抗原一同加入到預包被抗γ-干擾素抗體的培養孔中37℃二氧化碳孵育16-20小時檢測過程洗滌培養孔加標記二抗孵育1小時檢測過程洗滌培養孔加顯色液用蒸餾水終止反應檢測過程1個斑點=1個效應T細胞檢測過程陰性結果陽性結果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）實際效果圖四、比較結核病的常規診斷方法（1）細菌學檢查是結核病診斷的金標準，但涂片陽性率低，培養又耗費時日（2）分子生物學檢查雖然快速、靈敏，但操作煩瑣、技術要求高（3）結核抗體診斷診斷價值有限，但其簡便、快速，可以作為結核病的輔助診斷方法之一（4）PPD（TST）實驗傳統的結核感染檢測方法，對于接種過卡介苗(BCG)或環境分枝桿菌感染的受試者會出現一定的假陽性結果，對于使用激素或免疫抑制劑的受試者會出現一定的假陰性結果1、方法學比較——細菌學細菌學檢測——涂片、培養結核病診斷的“金標準”涂片：快速，簡便，特異性較好，靈敏度差培養：耗時長，特異性高，靈敏度稍高于涂片——美國FDA臨床數據——國內臨床數據——國內外文獻2、結核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陰性結果：1、表示未受結核菌感染2、某些情況下不排除已受結核菌感染,使用免疫抑制劑等;免疫功能低下如重癥結核病,慢性消耗性疾病,腫瘤,艾滋病,高齡等。3、陰性也不表示沒有結核感染.值得注意的是假陰性情況,在臨床上有感染結核的確切依據而患者PPD試驗卻陰性,這種情況常見于以下疾?。撼醮胃腥窘Y核菌4～8周以內,重度營養不良,惡性腫瘤,機體免疫缺陷性疾?。ㄏ忍煨悦庖呷毕莅Y,艾滋?。?免疫抑制劑使用者等,個別老年人因機體變態反應功能低下也常呈陰性反應。結核菌素皮試——PPDPPD的臨床意義——陽性結果：1.一般陽性和中度陽性：結核病現癥患者；已受結核菌感染但并不意味著發病或患?。豢ń槊缃臃N所致變態反應；2.強陽性：結核病患者；感染結核菌未發病者.強陽性人群結核病的發病率高,在未找到病變時可作預防性治療。

T-SPOT.TB

與皮試的比較皮試TST(PPD)的影響因素1、免疫力狀況——年齡、藥物2、交叉反應——卡介苗、環境分枝桿菌3、檢測操作、結果判斷方法學比較——TSTVsT-SPOT.TB假陽性—卡介苗接種—環境分枝桿菌假陰性—免疫力狀況—年齡（新生兒、老年人）—藥物特異性—不受卡介苗接種影響—不受環境分枝桿菌影響靈敏度—基本不受免疫力狀況影響—肺外結核檢出率高—藥物、年齡例：研究數據293例懷疑結核病的非洲兒童平均年齡3歲，約46%HIV抗體陽性，多數合并營養不良57例確診結核病的兒童中，ELISPOT陽性率81%；TST陽性率35%年齡、HIV感染狀態和營養不良的嚴重程度對ELISPOT結果無影響，但均能導致TST結果的顯著差異LiebeschuetzetalLancet.2004方法學比較——TSTVsT-SPOT.TBT-SPOT.TBtestTSTStudiesofIGRASpecificityinSubjectsinLowEndemicitySettingsSubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%SubjectsNumberpositivesPositiveRate"Specificity"%AdamsetalScandJInfectDis.2008;40(3):196-203.1800.0%100.0%

BocchinoetalEurJClinMircroInfectDis(2008)

May10*49510.2%89.8%50816.0%84.0%DetjenetalClinInfectDis2007Aug1;45(3):322-8*4012.5%97.5%401742.5%57.5%BarsegianetalJHospInf(2008)epubaheadofprint9511.1%98.9%953233.7%66.3%ClarketalClin&ExpImmunol2007Nov;150(2):238-444700.0%100.0%

DhedaetalAIDS200519;2038-411800.0%100.0%

MeieretalEJCMID200524;529-5361100.0%100.0%1100.0%100.0%SUBTOTAL(T-SPOTvs.TSThead:headstudiesonly)19573.6%96.4%1965729.1%70.9%五、臨床及評價1、將該產品（方法學IGRA）

寫入診療指南的國家（Guidelines）英國、愛爾蘭、德國、法國、意大利、瑞士、荷蘭、葡萄牙、丹麥、挪威美國、加拿大日本、韓國、澳大利亞等指南解讀（一）建議用IGRA替代TST用于結核篩查德國、英國、瑞士、丹麥、波蘭等適用于抗TNF-α

治療人群指南解讀（二）TST和IGRA兩者均可美國、法國、澳大利亞、日本等卡介苗(BCG)接種人群首選IGRA（美國）指南解讀（三）兩步法：先用TST，再用IGRA以提高靈敏度與特異性加拿大、西班牙、荷蘭、韓國、澳大利亞等主要適用于接觸追蹤2、應用方向1）結核病輔助診斷/療效評價“菌陰”結核病患者的輔助診斷肺外結核的鑒別診斷抗癆治療的療效評價2）免疫力低下/受抑制患者的結核診斷/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者的結核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3）兒童結核病的輔助診斷4）結核密切接觸者/高危人群的結核感染篩查結核病患者的家屬/醫務工作者/監獄囚犯5）接觸追蹤對于“涂陰”結核病患者有很高的檢出率（94.2%）對于肺外結核病患者有很高的檢出率（90.3%）對于結核潛伏感染的檢測，不受卡介苗（BCG）接種影響，比PPD檢測更準確不能夠提示臨床患者的病變部位不能夠根據斑點數量的多少來判斷受試者是活動性結核病患者或是潛伏感染者對于結核/癌癥患者的鑒別診斷，須結合臨床癥狀進行判斷科室特點消化科——腹水待查——腸結核的鑒別診斷——發熱待查——生物制劑治療前結核篩查科室特點呼吸/傳染/感染科——呼吸系統疾病與結核鑒別診斷——胸水/心包積液鑒別診斷——肺外結核輔助診斷——發熱待查科室特點風濕免疫科——生物制劑/免疫抑制/激素等藥物的使用——結核篩查——肺結核與肺間質病的鑒別診斷——發熱待查科室特點兒科——兒童肺結核的輔助診斷——