第六節

蛋白質的分離純化和分析1一、蛋白質分離純化的一般程序

（一）材料的預處理及細胞破碎分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。1.機械破碎法——利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。2.滲透破碎法

——在低滲條件使細胞溶脹而破碎。23.反復凍融法

生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。該法簡單方便，但對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。4.超聲波法

使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。5.酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。3(二)蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等應根據性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（SDS、tritonX-100等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。4蛋白質分離純化的方法很多，主要是根據蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。

性質方法分子大小——透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度——等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀電荷——電泳、離子交換層析吸附性質——吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）特異性結合——親和層析5蛋白質的分離純化方法分子大小透析和超過濾：透析指利用蛋白質分子不能通過半透膜而與小分子分離；超濾是利用壓力或離心力使小分子溶質通過半透膜而蛋白質被截留在膜上而分離。密度梯度離心：蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降得快，且每種蛋白質顆粒沉降到與其自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成不同的區帶。凝膠過濾：即分子排阻層析。凝膠顆粒內部為多孔的網狀結構。大分子最先流出層析柱。溶解度等電點沉淀和pH控制鹽溶和鹽析：中性鹽在低濃度時可增加蛋白質的溶解度，即鹽溶。原因是蛋白質分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而與水分子相互作用加強；當離子強度增大到足夠高時，此時與蛋白質疏水基團接觸的自由水被移去以溶劑化鹽離子，導致蛋白質疏水基團暴露，使蛋白質因疏水作用凝聚沉淀。有機溶劑分級分離法：一是降低介質的介電常數，二是與蛋白質爭奪水化水。溫度沉淀：溫度對溶解度有影響，低溫穩定，高溫不穩定。在0-40℃，大部分的球狀蛋白質溶解度隨溫度升高而增加。6蛋白質分離純化方法電荷電泳（凈電荷、分子大小、形狀）區帶電泳聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）毛細管電泳離子交換層析等電聚焦：外加電場時，蛋白質混合物在具有pH梯度的介質中移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH處，形成區帶。層析聚焦：層析柱中建立連續的pH梯度，蛋白質樣品由柱上端隨緩沖液的展開而聚焦在各自的等電點pH處，形成區段。吸附：吸附層析，吸附劑（硅石、氧化鋁、活性碳）和疏水吸附劑，與待分離分子和雜質分子的吸附與解吸能力不同。特異親和力：親和層析其它：如高效液相層析（HPLC）,快速蛋白液相層析（FPLC）7（三）蛋白質粗制品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離。主要根據蛋白溶解度的差異。1.等電點沉淀法2.鹽析法分步鹽析分離不同蛋白質。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。3.有機溶劑沉淀法如乙醇、丙酮等，它們的介電常數比水低，能降低球狀蛋白質溶解度;有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。有機溶劑會使蛋白質變性，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。8（四）樣品的進一步分離純化用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。9純化方法1.

凝膠過濾法

(GelFiltrationChromatography，GFC)也稱凝膠過濾或分子排阻層析。這是根據分子大小分離蛋白質混合物有效的方法之一。凝膠過濾所用的介質一般是:交聯葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl10（1）葡聚糖凝膠商品名Sephadex它由線形α－1，6－葡聚糖和3-氯-1,2環氧丙烷以醚鍵相互交聯而成的化合物。通過控制葡聚糖和交鏈劑的比例及反應條件決定其交聯度的大小，從而得到各種規格的葡聚糖凝膠。用G表示交聯度，G越小，交聯度越大，凝膠中網眼越小，吸水量就越小。11葡聚糖凝膠的外觀為白色珠狀顆粒，在顯微鏡下放大700倍，可見其表面的網狀皺紋。它帶有大量的羥基，親水性好，因此在水溶液或電解質溶液中極易膨脹。由于各種型號的葡聚糖凝的交聯度(交聯劑在葡聚糖凝膠中占的百分數)不同，致使其在水中的膨脹度(床體積)、吸水量(每克干凝膠在水中充分膨脹所需的水量。但不包括顆粒間所帶的水量)、篩孔的大小和分級范圍有明顯的差異。例如，SephadexG—25比G—100交聯度大。而影脹度、吸水量和篩孔直徑前者小于后者。另外，前者對球形蛋白分級范圍較窄。即在1000(下限)一5000(上限)之間，而后者范圍較寬，即在4000—150000之間。12表Sephadex1的種類與特性型號分離范圍（分子量）最小溶脹時（h）20℃～25℃100℃G10＜7001.0±0.13

12~3G15＜15001.5±0.23

12.5~3.5G25＜50002.5±0.23

14~6G501500～200008.0±0.33

19~11G753000～700007.5±0.524

112~15G1004000～15000010.0±1.072

115~20G1505000～80000015.0±1.5

72

120~30G2005000～300000020.0±2.072

130~40）床體積（ml）/干凝膠（mg吸水量（ml/g）13Sephadex的穩定性

葡聚糖凝膠在水、鹽、堿、弱酸溶液和有機溶劑中是穩定的，不溶解的，而且很少產生化學降解。在中性條件下，葡在0．1m01／LHCl溶液中浸泡1—2小時，甚至在0．02m01／LHCl溶液中浸泡6個月以上，對分離效果無明顯的影響。但是，當暴露于強酸或氧化劑溶液時，則容易使糖苷鍵水解斷裂，因此，要避免與其接觸。葡聚糖凝膠欲在室溫下長期保存時，應加入適量的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。不然，微生物將生長。14吸附性：

葡聚糖凝膠系弱酸性物質。這是由于其每克干膠中含10—20微克當量的羧基基團所致。該基團能與分離物中電荷基團(尤其是堿性蛋白質)發生吸附作用。但是，這種吸附作用可以借助提高洗脫液的離子強度得以克服。當離子強度大于0.05時，一般對弱堿性蛋白質就無吸附力了。因此進行葡聚糖凝膠層析時，常用含有NaCL的緩沖液作洗脫液。

15新的葡聚糖凝膠對蛋白質往往有不可逆的吸附性能，雖然吸附的數量較少，但是在制作測定蛋白質分子量的標準曲線時，或者分離純化極難得到的物質時，需先用易得到的蛋白質進行預層析，以便消除其影響。此外，葡聚糖凝膠對芳香族化合物或雜環化合物以及某些凝集家具有較強的吸附作用，若采用凝膠過濾層析分離它們時，往往利用的是吸附原理，而不是排阻原理。16（2）瓊脂糖疑膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的。在制備過程要盡可能將其中硫酸根和羧基基團的瓊脂膠除去，才能得到不帶電荷基團的瓊脂糖。瓊脂糖是由D—半乳糖和3、6脫水的L—半乳糖連接構成的多糖鏈。這種多糖鏈在100℃左右時呈液態，當溫度下降到45℃以下時，它們之間以氫鍵方式相互連接就成了線性的雙鏈單環的瓊脂糖，經凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。17瓊脂糖的商品名稱是因生產廠家不同而異瑞典稱Sepharose美國稱Bio－gelA英國稱Segavac中國的同類產品與瑞典相同。這些瓊脂糖中除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。18瓊脂糖凝膠對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力；在pH4.4-9.0的緩沖液中穩定。室溫保存，其物理穩定性超過了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝膠。瓊脂糖凝膠在干燥狀態下保存時易破裂，故放在含防腐劑的水溶液中，同時還要避免劇烈的攪動。脂糖凝膠按其濃度來分有Sepharose2B(2％濃度)、4B和6B(6％)。Sepharose6B的機械強度大于2B，但是篩孔小于2B.19

Sepharose與1，3—二溴異丙醇在強堿性條件下反應后，即生成CL-型交聯瓊脂糖。這種瓊脂糖的篩孔與同濃度的未交聯的瓊脂糖相同，但熱穩定性和化學穩定性大大提高。CL-型交聯瓊脂糖可在廣范圍的pH溶液中使用(pH3～13）,即使較強的堿溶液短時間處理，期性能也不會改變。但在氧化劑存在時，會有少量的多糖鏈發生解聚。瓊脂按凝膠的機械強度和篩孔的穩定性都比葡聚糖凝膠好。20產品名稱規格特性及應用價格瓊脂糖凝膠FF100ml用于大分子蛋白、超螺旋DNA、病毒純化等生物大分的分離純化。包括這些樣品的除鹽等。分離范圍1x104-41x106￥600瓊脂糖凝膠FF500ml￥200021（3）聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠的商品名稱為Bio—ge1。它是以甲撐雙丙烯胺胺(雙體)作交聯劑，以過硫酸銨作催化劑，在N、N、N’、N’—四甲基乙二胺(TEMED)加速劑的作用下，將丙烯酰胺(單體)聚合而成的。當改變單體濃度時，就可得到吸水串不同的產物。商品聚丙烯酰胺凝膠型號有Bio—ge1P—2到P—300，其阿拉伯數字相當于排阻限度的10—2。22一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，并以干凝膠形式出售，使用前必須溶脹。該凝膠不溶于水和普通有機溶劑，能忍受濃鹽、尿素和服鹽等溶液的浸泡；在pHl—10或短時間超過此pH范圍的溶液中較穩定；要避免長期與強酸和強堿接觸，如果與其接觸，并在高溫條件下，酰胺基將迅速發生分解。聚丙烯酰胺凝膠對芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現象，如使用離子強度略高的洗脫液操作，此弊病可以克服。23（4）SephacrylSephacryl是由烷基葡聚糖與甲撐雙丙烯酰胺共價交聯制成的。此凝膠屬硬性凝膠，它具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團。Sephacryl吸水時，其珠狀顆粒直徑平均值為70μm，通常是用于水相系統中。若在有機相系統使用時，其孔徑大小略有變化。它在所有的溶劑中不溶解，化學降解也很少；它可在pH2—11范圍內使用，當pH低時，葡聚糖鏈將發生少許水解作用；在0.2mol/LNaOH溶液中(室溫下)處理100小時，對其低流速和多孔性沒有明顯影響。用清潔劑(如SDS)、6mol／L鹽酸胍和8尿素溶液作洗脫劑，高溫消毒(120℃,

pH7)處理后，層析性質沒有明顯變化。24分子篩效應：大分子先洗脫下來小分子后洗脫下來25也叫凝膠過濾層析26凝膠過濾色譜原理

凝膠層析所用的基質是具有立體網狀結構、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質。這種物質可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數Kav（被分離化合物在內水和外水體積中的比例關系）表示。

27Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的層析條件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，Kav值小；反之，則Kav值增大。28在同一凝膠柱上分離Mr不同的物質時，由于流動相的作用，這些分離物質將發生排阻和擴散效應。若緩沖液連續地傾入柱中，柱中物質的排阻和擴散效應也將連續地發生，其最終結果是分子量大的物質先從柱中流出，分子量小的物質則后從柱中流出。29流出物用部分收集器分管等量或等時地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子量不同的物質相互分離開了。30其分離效果受操作條件（如基質的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大小、洗脫液的流速以及樣品的種類等）的影響，而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。分配系數Kav既是判斷分離效果的一個參數，又是測定蛋白質分子量的一個依據。從公式Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要測出床體積Vt和外水體積Vo以及洗脫體積Ve，即可計算出Kav值。31凝膠床總體積Vt可用二種方法得到：計算法：根據層析柱體積計算總體積，可用下列公式表示Vt=r2h式中r為層析柱半徑；h為凝膠床高度；為圓周率。在用此公式計算凝膠床總體積時，須精確地分段測量，以防內徑不勻造成誤差。另外還須注意到，在層析過程中，尤其是軟膠的操作壓力要小，以防凝膠床的高度降低。

測量法：由凝膠床的組成可知，床體積Vt等于外水體積Vo、內水體積Vi與凝膠顆粒實際占有體積Vg之和。即Vt=V0+Vi+Vg因Vg與Vt相比很小，可忽略不計，故Vt=V0+Vi32Vo和Vi可通過實驗測得：

當把分子量不同的混合溶液鋪在凝膠床上時，其在內水體積和外水體積中的分布是不一樣的。溶液中的分子大于凝膠孔徑上限者不能進入凝膠網孔內，而被排阻在外水體積的溶液中。凝膠床的洗脫體積Ve剛好等于外水體積。即Ve=Vo(Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝膠孔徑下限者能自由進入凝膠網孔內，凝膠床的洗脫體積Ve應等于凝膠床總體積，即Ve=Vt=Vo+Vi(Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝膠孔徑上限和下限之間者，則能進入部分凝膠網孔中，故其洗脫體積Ve是在Vo和Vt之間（Kav在0-1之間）。33測定外水體積的物質——通常選用藍色葡聚糖2000。該物質分子量大（為200萬），呈藍色，它在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可借助其本身顏色，采用肉眼或分光光度儀檢測（210nm或260nm或620nm）洗脫體積（即Vo）。但是，在測定激酶等蛋白質的分子量時，不宜用藍色葡聚糖2000測定外水體積，因為它對激酶有吸附作用，所以有時用巨球蛋白代替。測定內水體積（Vi）的物質——可選用硫酸銨、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它與凝膠無吸附力的小分子物質。34凝膠色譜實驗方法與步驟1.葡聚糖凝膠的預處理取3克葡聚糖凝膠（Sephadex-25）干粉，浸泡于50ml蒸餾水中充分溶脹（室溫，12h），然后反復傾斜除去表面的懸浮微粒，再加入pH7.0磷酸緩沖液沸水浴中2-3h去除顆粒內部空氣，最后加入pH7.0磷酸緩沖液浸泡過夜備用。2.裝柱(1)將層析柱垂直固定在鐵架臺上,不要顛倒；(2)將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約1-2cm高的緩沖液，把溶脹好的糊狀凝膠邊攪拌邊倒入柱中，最好一次連續裝完，若分次裝入，需用玻璃棒輕輕攪動柱床上層凝膠，以免出現界面。最后放入略小于層析柱內徑的圓形濾紙片，以防將來加樣時凝膠被沖起。35

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