第2節

微生物的培養技術及應用01一生物的基本培養技術（第2課時）第1章發酵工程在微生物學中，將接種于培養基內，在合適條件下形成的含特定種類微生物的群體稱為培養物。由單一個體繁殖所獲得的微生物群體稱為純培養物。1.相關概念2.微生物純培養的步驟三、微生物的純培養培養物：純培養物：純培養：獲得純培養物的過程就是純培養。配制培養基滅菌接種分離培養等酵母菌的純培養微生物群分散或稀釋單個細胞繁殖單菌落(1)菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落(2)單菌落：一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。(3)獲得單菌落的方法：稀釋涂布平板法、平板劃線法1.實驗原理特征：大小、形狀、隆起程度、顏色等功能：鑒定菌種的重要依據單個微生物固體培養基上大量繁殖子細胞群體菌落在相同培養條件下，同種微生物表現出穩定的菌落特征酵母菌的純培養酵母菌的純培養

2.目的要求

(1)學會配制培養酵母菌的培養基并倒平板。

(2)學會進行無菌操作。

(3)嘗試通過平板劃線操作來獲得純化的酵母菌菌落。

3.材料用具

酵母菌培養液、馬鈴薯、葡萄糖(或蔗糖)、瓊脂、蒸餾水、天平、小刀、紗布、燒杯、錐形瓶、棉塞、牛皮紙(或報紙)、皮筋、培養皿、接種環、酒精燈、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌箱和恒溫培養箱等。4.方法步驟配制培養基稱取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1000ml，加熱煮沸至馬鈴薯軟爛，用紗布過濾。向濾液中加入20g葡萄糖（也可用蔗糖代替）、15~20g瓊脂，用蒸餾水定容至1000ml。滅菌

將配制好的培養基轉移到錐形瓶中，加棉塞，包上牛皮紙，并用皮筋勒緊，再放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在壓力為100kPa、溫度為121℃的條件下，滅菌15~30min。將5～8套培養皿包成一包，用幾層牛皮紙包緊，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃滅菌2h。倒平板待培養基冷卻到50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板。酵母菌的純培養（1）制備培養基④等待培養基冷卻凝固后，將培養皿倒轉過來放置①拔出錐形瓶的棉塞②將瓶口迅速通過火焰倒平板的具體操作步驟③用拇指和食指將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養基（10-20mL）倒入培養皿，立即蓋上皿蓋。倒平板注意事項：①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置酵母菌的純培養

瓊脂是一種多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，倒平板時，高于50℃則會燙手，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固。3.為什么倒平板時，將培養皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，不能完全打開？防止雜菌污染培養基實驗注意事項、分析、思考1.培養基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時開始倒平板？2.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。酵母菌的純培養6.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？最好不要用這個平板培養微生物。防止空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生。4.為什么倒平板和接種整個過程要在酒精燈火焰旁進行？避免雜菌污染5.倒平板時為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。實驗注意事項、分析、思考酵母菌的純培養將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養12h～24h，觀察是否有菌落存在以確定是否被污染或滅菌是否徹底。8.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？7.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。實驗注意事項、分析、思考酵母菌的純培養（2）接種和分離酵母菌

通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經過數次劃線后培養可以分離得到單菌落。連續劃線法分區劃線法酵母菌的純培養4.方法步驟平板劃線的具體操作步驟①將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環的金屬絲燒紅。②在火焰旁冷卻接種環，并拔出裝有酵母菌的棉塞。③將試管口通過火焰④將已冷卻的接種環伸入菌液中，蘸取一環菌液。⑤將試管通過火焰，并塞上棉塞。⑥左手在火焰附近將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基。⑦灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三、四、五區域內劃線。注意不要將最后一區的劃線與第一區相連。酵母菌的純培養平板劃線的具體操作步驟12345灼燒接種環蘸取菌液第1區接種灼燒接種環第2區接種灼燒接種環第3區接種第5區接種注意：①接種環只蘸一次菌液,但要在培養基不同位置連續劃線多次。②劃線首尾不能相接③每次劃線前接種環進行滅菌；在5個區域劃線，接種環灼燒滅菌共6次。④劃線后,培養皿倒置培養平板劃線完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃

左右（培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養箱中培養24~48h。

警示：在實驗室中，切不可吃東西、喝水，離開實驗室時一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養基在丟棄前一定要進行滅菌處理，以免污染環境。

（3）培養酵母菌酵母菌的純培養4.方法步驟1.在未接種的培養基表面是否有菌落生長?如果有,說明了什么?2.在接種酵母菌的培養基上,你是否觀察到了單菌落?這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致?如果你觀察到了不同形態的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎?3.你是如何記錄實驗結果的?請與其他同學交流、互評。提示1：在未接種的培養基表面應該沒有菌落生長，如果有，說明培養基被雜菌污染。提示2：如果觀察到了不同形態的菌落，可能是接種的菌種不純或無菌操作不規范等原因引起的。5.結果分析與評價酵母菌的純培養

1.為什么在操作第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時,仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結束后殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數目逐漸減少，直至得到單個細胞。殺死接種環上原有微生物6.實驗注意事項、分析、思考酵母菌的純培養2.在灼燒接種環之后，要等其冷卻再進行劃線，目的是什么？避免溫度過高殺死菌種使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐漸減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落①一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；②存留在劃破處的單個細胞無法形成規矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落4.為什么劃線時要注意不能劃破培養基？3.除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開始，目的是什么？5.未接種的培養基直接培養起什么作用？

做空白對照，若培養后培養基表面無菌落，則說明培養基沒有污染。6.實驗注意事項、分析、思考酵母菌的純培養評估論點的可信程度

有一段時間，水果“酵素”風靡各地。水果“酵素”制作的大致過程是：將洗凈、切成塊狀的水果放入潔凈的容器，再加入糖和水,密封，置于陰涼處發酵一至兩周。有人說，吃水果“酵素”可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力。請評估這一論點是否可信。追問以下問題可以幫助你分析。“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人們無法從其他食品中獲取但又是維護健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人體健康嗎？如果要更加有力地支持或反駁水果“酵素”有益健康的論點，應該怎樣獲取證據？

所謂“酵素”，就是“酶”的另一種說法。“酵素”制作就是利用微生物進行無氧呼吸的原理，進行像制作泡菜一樣的發酵。這樣制作的“酵素”中可能有糖類(包括-些簡單的糖和膳食纖維等)、蛋白質(包括多種酶)、有機酸等成分，不存在它獨有的、特殊的營養物質，其中甚至可能含有微生物發酵產生的有毒物質，食用后可能會危害人體健康。因此，“吃水果酵素可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力”的論點值得懷疑。

1.微生物的純培養既需要適宜的培養基，又要防止雜菌污染。判斷下列相關表述是否正確。（1）培養基中的營養物質濃度越高，對微生物的生長越有利。（）（2）消毒和滅菌的殺菌程度存在差異。（）（3）微生物的純培養物就是不含有代謝廢物的微生物培養物。（）×√×練習與應用一、概念檢測

2.日常生活中保存食品的方法有哪些？這些方法是如何阻止或抑制微生物生長的？提示：日常生活中保存食品的方法有干制、腌制、低溫儲存等。干制可以降低食品的水分含量；腌制可以通過食鹽、糖等制造高滲環境，從而抑制微生物的生長和繁殖；低溫則是通過降低微生物的代謝速率來抑制微生物的生長和繁殖。練習與應用一、概念檢測

1.某同學將5個手指尖在貼有“洗手前”標簽的培養基上輕輕按一下。然后用肥皂將該手洗干凈，再將5個指尖在貼有“洗手后”標簽的同種培養基上輕輕按一下。將這兩個培養皿放入37℃恒溫培養箱中培養24h后，發現貼有“洗手后”標簽的培養皿中菌落較少。請分析回答下列問題。（1）這個實驗中需要進行滅菌處理的材料用具有（2）“將指尖在培養基上輕輕按一下”相當于微生物培養中的哪一步操作？（3）從實驗結果來看,洗手后我們就能進行無菌操作了嗎？操作時，我們可以采用什么方法來避免手上微生物的污染？提示（1）：培養皿和培養基。提示（2）：接種。（3）提示：通過實驗結果可以看到，洗手后手上還有一些微生物，不能直接進行無菌操作。可以通過用酒精棉球擦拭雙手，或戴消過毒的手套等方法來避免手上微生物的污染。二、拓展應用練習與應用

2.某生物興趣小組將從葡萄皮上成功分離來的野生酵母菌分別接種于3個盛有等量同種液體培養基的錐形瓶中，并放置