參數檢測第一頁，共45頁。例：鳥苷消費在鳥苷發酵中，發現發酵到40小時后鳥苷合成速率下降，但糖耗速率并未下降，而且由于耗糖,使發酵過程pH下降，補入氨水增多。那么糖耗到哪里去了呢？于是進展以下一些測定與分析第二頁，共45頁。什么因素導致pH下降？1、有機酸的積累有機酸積累pH下降補加氨水在正常代謝情況下，細胞通過EMP途徑和TCA循環的過程是為細胞合成提供前體和能量的，按照細胞經濟學的原則不會供過于求，即不會出現有機酸的積累若發酵后期有機酸積累會引起加入的[NH4+]積累，相應出現產苷速率下降。——代謝不正常第三頁，共45頁。測定以下中間物發酵后期丙酮酸積累第四頁，共45頁。2、氨基酸的積累在有機酸分析的根底上進一步通過HPLC測定發酵過程中不同時間發酵液中氨基酸，結果發現總氨基酸積累并且其積累晚于有機酸和[NH4+]積累。第五頁，共45頁。氨基酸成分分析說明，初始發酵液中谷氨酸濃度比較高，其它氨基酸濃度都較低，隨著發酵過程的進展谷氨酸很快被用于菌體合成，在8小時之前已經降到很低程度，并始終維持在低程度，而在48小時左右丙氨酸開場出現明顯的積累，發酵液中積累量到達初始量的12.6倍之多，其它十余種氨基酸濃度那么變化不大，并且在整個發酵過程中都維持在較低程度。因此，丙氨酸濃度變化可能是導致代謝流遷移所致。第六頁，共45頁。3、分析原因發酵過程中積累的氨基酸主要是丙氨酸，而丙氨酸的合成可以直接由丙酮酸轉化而來，因此可以推斷由于EMP途徑代謝流的增加造成了丙酮酸的積累，丙酮酸隨后轉化為丙氨酸丙氨酸本身又會對谷氨酸合成酶〔GS〕造成反響抑制和阻遏，使產苷速率降低。第七頁，共45頁。惡性循環激活磷酸果糖激酶丙酮酸積累氨水補加增加[NH4+]積累抑制GS抑制TCA循環丙酮酸積累EMP流量增加丙氨酸積累第八頁，共45頁。〔二〕代謝流遷移的酶學證明糖代謝途徑關鍵酶糖酵解途徑〔EMP〕在糖酵解途徑中有兩個不可逆的步驟的酶：磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶磷酸果糖激酶的時序分析第九頁，共45頁。12小時時由于生長處于對數生長初期，代謝活力較低，所以PFK的活力相對較低。24小時后隨著發酵過程進入平穩產物形成期和細胞生長期，磷酸果糖激酶的活力也根本保持平穩。但是到40小時以后，鳥苷形成速率減慢甚至停頓，同時觀察到氨基酸和有機酸積累，PFK相對酶活增加，這說明此時通過EMP途徑的糖代謝通量已有了明顯的增加。第十頁，共45頁。丙酮酸激酶時序分析第十一頁，共45頁。丙酮酸激酶沒有表現出明顯的酶活增加，而是在24小時就根本上到達其最大值，隨后維持在恒定的程度，這說明在糖代謝時EMP途徑代謝流增加中丙酮酸激酶所起的作用不大，不是造成代謝流遷移的主要因素磷酸戊糖途徑〔HMP〕關鍵酶磷酸戊糖途徑中主要的限速酶是6－磷酸葡萄糖脫氫酶，該酶催化6－磷酸葡萄糖脫氫生成6－磷酸葡萄糖酸內酯。第十二頁，共45頁。6－磷酸葡萄糖脫氫酶時序分析由圖可以看到，早期6－磷酸葡萄糖脫氫酶活力很高，這可能是前期菌體合成代謝比較活潑，通過HMP途徑合成用于細胞成分的核酸等組成物質；隨后根本不變，從而保持EMP和HMP途徑通量的平衡，此時穩定持續的形成產物；但是到40小時后，6－磷酸葡萄糖脫氫酶已經表現出明顯的下降趨勢，并且隨著后期發酵過程的進展而持續下降。根據物料平衡原那么，有可能糖代謝在HMP途徑通量下降而EMP途徑通量增加。第十三頁，共45頁。三羧酸(TCA)循環的關鍵酶三羧酸循環是“消耗〞丙酮酸的途徑，三羧酸流量大丙酮酸不會積累。三羧酸循環中的關鍵酶為檸檬酸合成酶，其催化乙酰輔酶A與草酰乙酸縮合形成檸檬酸，是三羧酸循環的啟動步驟，也是三羧酸循環中的主要控制點，由檸檬酸合成酶所催化的反響是三羧酸循環中的第一個限速步驟。第十四頁，共45頁。檸檬酸合成酶時序分析第十五頁，共45頁。從圖可以看到，TCA循環的關鍵酶檸檬酸合成酶在整個發酵過程中，尤其是在后期產苷速率下降的過程中都維持比較平穩的程度，這說明在發酵過程后期所發生的代謝流遷移時，TCA循環的通量并沒有發生明顯的增加。即代謝流遷移發生在EMP和HMP之間，主要是由于EMP和HMP途徑之間的分配平衡被打破所造成的。EMP途徑代謝流的增加造成了一種代謝流的溢流現象。第十六頁，共45頁。丙氨酸脫氫酶的時序分析第十七頁，共45頁。在發酵中后期，丙氨酸脫氫酶活力出現了明顯的增加。丙氨酸脫氫酶催化由丙酮酸生成丙氨酸，該酶活性增加與丙酮酸和丙氨酸的時序增加相吻合，這些數據說明代謝流的溢流現象發生在檸檬酸合成酶之前的丙酮酸節點，通過丙氨酸脫氫酶生成丙氨酸，從而緩解了EMP途徑代謝流增加造成的代謝不平衡。結果參加EMP途徑的抑制劑，抑制了代謝流遷移的問題，進步了鳥苷的產量第十八頁，共45頁。基因工程菌第十九頁，共45頁。〔三〕基因不穩定性消費的目的是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成對宿主細胞是有損害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的才能的細胞一般生長得快得多，從而能替代有消費才能的菌株，這就導致基因的不穩定性。基因的不穩定性原因：別離喪失構造不穩定性宿主細胞調節突變第二十頁，共45頁。1、別離喪失指工程菌分裂時出現一定比例不含質粒子代菌的現象。為什么會出現質粒喪失呢？質粒可分為高拷貝質粒〔>20拷貝/細胞〕和低拷貝質粒〔有時低到每個細胞一至二個拷貝〕。低拷貝質粒有專門的機制保證在子代細胞中有相等的分配，高拷貝質粒通常很少遵循二分法分配到子代細胞。對于高拷貝質粒，絕大多數子細胞承受一些質粒，也有可能有的細胞沒有承受質粒，出現質粒喪失。雖然形成無質粒細胞的可能性是低的〔每百萬細胞分裂中一個〕。第二十一頁，共45頁。在大的反響器中含有非常多的細胞，總會存在無質粒細胞，例如1000L發酵液，每毫升有109個細胞，總共就有1015個細胞，那么在這個反響器中就含有109個無質粒細胞。質粒的別離喪失受許多環境因素影響，如溶氧、溫度、培養基組成和恒化器中的稀釋速率。許多質粒也會形成多聚體，它是一樣質粒附著在一起形成一個單位。第二十二頁，共45頁。別離喪失示意圖第二十三頁，共45頁。2、質粒構造不穩定性指外源基因從質粒上喪失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。假如質粒發生突變，仍保存了抗生素抗性基因，但不合成外源蛋白，那么這些突變株仍能在含有抗生素的培養基中生長。而且由于不合成外源蛋白，生長得比原來的工程菌更快，使得在這種培養物中帶有突變質粒的菌占統治地位，這種培養情況就是構造不穩定性。第二十四頁，共45頁。3、宿主細胞突變

宿主細胞的突變也會造成消費才能的下降。這些突變通常改變細胞調節，結果減少目的蛋白的合成。例如，控制外源蛋白表達的啟動子，利用宿主細胞的啟動子，假如宿主細胞啟動子的改變，將大大改變質粒編碼蛋白的消費程度。乳糖操縱子是常用是操縱子，通過參加乳糖或它的構造類似物〔如IPTG〕來啟動表達，假如乳糖操縱子編碼半乳糖苷透酶的基因發生突變就會阻止乳糖或乳糖的構造類似物進入細胞，從而不能啟動細胞的表達。第二十五頁，共45頁。4、生長速率占優勢的不穩定性所有這三種因素的關鍵是變異了的宿主載體系統和原宿主-載體系統的生長速率不同。假如變異了的宿主載體系統比原來的宿主-載體系統有生長優勢，那么變異了的系統將最終占優勢，基因不穩定性就出現。〔四〕表達的誘導基因工程菌的產物表達需要誘導，誘因主要有：溫度誘導、乳糖或乳糖構造類似物誘導、氧饑餓誘導、葡萄糖饑餓誘導、甲醇誘導等。第二十六頁，共45頁。進步質粒穩定性的方法1、兩階段培養法：第一階段使菌體生長至一定密度，第二階段誘導外源基因的表達。在培養基中參加選擇性壓力如抗生素等，以抑制質粒丟失菌的生長。2、通過控制環境參數〔溫度、PH、培養基組分和溶解氧濃度〕，調節比生長速率，使工程菌生長具有優勢。有些含質粒的菌對發酵環境的改變比不含質粒的菌反響慢，因此間歇改變培養條件以改變這兩種菌的比生長速率，可以改善質粒的穩定性。第二十七頁，共45頁。染菌第二十八頁，共45頁。3、不同時間染菌對發酵的影響污染時間是指用無菌檢測方法確準的污染時間，不是雜菌竄入培養液的時間。雜菌進入培養液后，需有足夠的生長、繁殖的時間才能顯現出來，顯現的時間又與污染菌量有關。污染的菌量多，顯現染菌所需的時間就短，污染菌量少，顯現染菌的時間就長。第二十九頁，共45頁。〔1〕種子培養期染菌由于接種量較小，消費菌生長一開場不占優勢，而且培養液中幾乎沒有抗生素〔產物〕或只有很少抗生素〔產物〕。因此它防御雜菌才能低，容易污染雜菌。如在此階段染菌，應將培養液全部廢棄。第三十頁，共45頁。〔2〕發酵前期染菌發酵前期最易染菌，且危害最大。原因發酵前期菌量不很多，與雜菌沒有競爭優勢；且還未合成產物〔抗生素〕或產生很少，抵御雜菌才能弱。在這個時期要特別警覺以制止染菌的發生。染菌措施可以用降低培養溫度，調整補料量，用酸堿調pH值，縮短培養周期等措施予以補救。假如前期染菌，且培養基養料消耗不多，可以重新滅菌，補加一些營養，重新接種再用。第三十一頁，共45頁。〔3〕發酵中期染菌發酵中期染菌會嚴重干擾產生菌的代謝。雜菌大量產酸，培養液pH下降；糖、氮消耗快，發酵液發粘，菌絲自溶，產物分泌減少或停頓，有時甚至會使已產生的產物分解。有時也會使發酵液發臭，產生大量泡沫。措施降溫培養，減少補料，親密注意代謝變化情況。假如發酵單位到達一定程度可以提早放罐，或者抗生素消費中可以將高單位的發酵液輸送一部分到染菌罐，抑制雜菌。第三十二頁，共45頁。〔4〕發酵后期染菌發酵后期發酵液內已積累大量的產物，特別是抗生素，對雜菌有一定的抑制或殺滅才能。因此假如染菌不多，對消費影響不大。假如染菌嚴重，又破壞性較大，可以提早放罐。第三十三頁，共45頁。帶圖題第三十四頁，共45頁。谷氨酸正常發酵與異常發酵溶解氧變化第三十五頁，共45頁。氧氣第三十六頁，共45頁。實例一對黃色短桿菌生物合成氨基酸時發現：菌體的臨界溶氧濃度為當溶氧濃度低于時，谷氨酸和天冬氨酸族氨基酸合成受到影響，但苯丙氨酸，纈氨酸和亮氨酸最正確合成的溶氧濃度分別為、和。第三十七頁，共45頁。從合成途徑中可知，谷氨酸和天冬氨酸族的氨基酸來自于三羧酸循環(TCA)的中間體，而苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸來自于糖酵解的中間體，即來自于丙酮酸和磷酸稀醇式丙酮酸。第三十八頁，共45頁。溫度第三十九頁，共45頁。在四環素發酵中，還發現生物熱和菌的呼吸強度的變化有對應關系，特別是在80小時以前。從此實驗中還可看到，當產生的生物熱到達頂峰時，糖的利用速度也最大。另外也有人提出，可從菌體的耗氧率來衡量生物熱的大小。四環素生物合成過程中系列參數的動態變化過程1：效價；2：呼吸強度；3：生物熱；4：糖濃度第四十頁，共45頁。第二題第四十一頁，共45頁。1、微生物對溫度的要求不同與它們的膜構造物理化學性質有親密關系根據細胞膜的液體鑲嵌模型，細胞在正常生理條件下，膜中的脂質成分應保持液晶狀態，只有當細胞膜處于液晶狀態，才能維持細胞的正常生理功能，使細胞處于最正確生長狀態微生物的生長溫度與細胞膜的液晶溫度范圍相一致。二、微生物與溫度相關性的原理第四十二頁，共45頁。2、蛋白質構造人們采用二種方案來研究酶在低溫條件下的構造完好性和催化功能：(1)通過自然或誘導突變，將特定殘基發生改變的蛋白與其天然構造進展比照；(2)比照同屬嗜熱、嗜溫及嗜冷菌的蛋白構造通過對嗜冷酶的蛋白質模型和x一射線衍射分析說明，嗜冷酶分子間的作用力減弱，與溶劑的作用加強，酶構造的柔韌性增加，使酶在低溫下容易被底物誘導產生催化作用第四十三頁，共45頁。嗜冷菌具有在0℃合成蛋白質的才能。這是由于其核糖體、酶類以及細胞中的可溶性因子等對低溫的適應，蛋白質翻譯的錯誤率最低。許多中溫菌不能在O0C合成蛋白質，一方面是由于其