過氧化氫酶的分離純化鑒定過氧化氫酶又稱觸酶，是一類廣泛存在于動物內臟，植物和微生物體內的末端氧化酶。過氧化氫酶專一分解過氧化氫，溶于水，幾乎不溶于乙醇，氯仿，乙醚。過氧化氫酶是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統的關鍵酶之一，其生物學功能是催化細胞內過氧化氫分解，防止脫脂過氧化。迄今為止，過氧化氫酶已經成為農業，食品業，乳制品業，紙漿和造紙業，以及農業環保產業中有應用價值的酶之一。實驗背景實驗原理勻漿使細胞破碎，讓細胞中的蛋白質釋放。用重金屬鹽沉淀，高速離心使產物與雜蛋白分離。凝膠柱利用凝膠粒子為固定相，根據料液中溶質相對分子質量的差別分離出所需的蛋白質。再用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據蛋白質的相對分子質量不同移動速度也不同，檢驗得到蛋白質的相對分子質量。最后用Folin-酚試劑法測蛋白質的濃度。實驗步驟1.粗酶的提取2.初步分離純化3.進一步分離純化4.過氧化氫酶鑒定粗酶的提取將10克的豬肝用剪刀剪碎，以料水質量比1:5的比例加水研磨，在高速勻漿機的作用下將其打成肝糜，用高速離心機12000rpm下離心15min，取上清液，即為粗酶液。初步分離純化在粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，配制為30%的溶液，用玻璃棒攪拌15min。再在高速離心機中12000rpm下離心15min，取上清液。將得到上清液放入鹽析袋中鹽析過夜。將鹽析袋置于攪拌子勻速攪拌的裝有蒸餾水的大燒杯中鹽析。鹽析時間為一夜。（使之鹽析充分）鹽析袋使用前需檢漏。進一步分離純化由于鹽析后的溶液中仍含有大量的雜蛋白，為防止雜蛋白堵塞S200凝膠柱，進樣前先進行一次抽濾。將抽濾所得液體進樣到S200凝膠柱中分離，設流速為1ml/min,壓力為0.5帕。收集峰上的溶液。抽濾設備S200凝膠柱出峰位置圖（藍線）0.00mlMethodRun2013-10-29,9:55:42,Method:,Result:c:\...\prime\ManualRuns(prime)\ManualRun0.RES0.00mlBaseTime{}0.00mlPause0.02013-10-29,9:55:42(Manual)0.00mlError:62CheckthattubepositionisOK0.00mlConcentration0%B0.00mlContinue2013-10-29,9:55:45(Manual)0.00mlFlow2.0ml/min11.72mlPause0.02013-10-29,10:01:37(Manual)11.72mlFlow0.0ml/min11.72mlContinue2013-10-29,10:01:51(Manual)11.72mlFlow2.0ml/min17.96mlPause0.02013-10-29,10:04:58(Manual)17.96mlFlow0.0ml/min17.97mlContinue2013-10-29,10:05:20(Manual)17.97mlFlow2.0ml/min116.74mlFractionsize3.0ml222.89mlFractionOff過氧化氫酶的鑒定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：制膠，將粗酶，硫酸銨沉淀后的酶液，凝膠柱分離后的溶液分別與溴酚藍以1:1比例混合沸水加熱5min制成樣品。將3個樣品及mark加樣至凝膠中，跑電泳，染色，脫色后觀察。

垂直板電泳裝置加樣樣品遷移方向標準蛋白質與待測樣品電泳圖譜144002500045000662001160009號峰上液體4號峰上液體3號峰上液體標準蛋白mark其它峰未跑出條帶條帶順序：過氧化氫酶經查資料得其相對分子量為57000KDFolin-酚試劑法測蛋白質濃度：標準曲線的測定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標準蛋白質溶液（濃度為250mg/ml）。用水補足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，于500nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質的量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線。樣品的測定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質20~250微克），按上述方法進行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對照。通常樣品的測定也可與標準曲線的測定放在一起，同時進行。即在標準曲線測定的各試管后面，再增加3個試管。根據所測樣品的吸光度值，在標準曲線上查出相應的蛋白質量，從而計算出樣品溶液的蛋白質濃度。注意，由于各種蛋白質含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質而變化。因而本測定法通常只適用于測定蛋白質的相對濃度（相對于標準蛋白質）。分光光度計蛋白質濃度（ug/ml）03.857.6915.3823.0830.7738.46吸光度00.0380.0750.1060.1820.2580.308經過電泳得出的條帶我們可以看出過氧化氫酶酶可能存在于3,4,9號峰中，所以我們取粗酶，3號峰、4號峰、9號峰的酶液做蛋白質濃度測定。A粗酶=1.499經標準曲線對照粗酶187.075ug/mlA3=0.174計算得蛋白質濃3號峰21.45ug/mlA4=0.185