生物學實驗教學中心WenzhouMedicalCollegeCentralLaboratoryofBiologyCO2培養箱使用李

東CO2培養箱WenzhouMedicalCollege

全世界的用戶對二氧化碳培養箱都有兩條最基本的要求，一是要求二氧化碳培養箱能夠對溫度、二氧化碳濃度和濕度提供最精確穩定的控制，以便于其研究工作的進展；二是要求二氧化碳培養箱能夠對培養箱內的微生物污染進行有效的防范。

CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege一、二氧化碳進氣壓力：0.08~0.1MPa(0.8-1bar)

壓力表選用：初級壓力25MPa，次級壓力0.2MPa。松→緊壓力低→高。進氣正常的現象。壓力過高的危害，注意安全。壓力調節穩定需要時間，原因：殘余氣體，壓力表不穩。。二、溫度控制培養箱的最低工作溫度一般是高于室溫5°C，空氣循環提高溫度均一性。溫度恢復時間（37℃），開門時間過長，超溫；水盤的水溫影響。門加熱系統，即使箱內相對濕度高達98%，所有內壁表面亦能保持完全干燥。

▼CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege三、二氧化碳濃度控制按培養基中的NaHCO3設定二氧化碳濃度：NaHCO31.97g/L，CO2濃度5%；NaHCO33.95g/L，CO210%。RPMI1640培養基每升2.1g碳酸氫鈉；DMEM每升3.7克碳酸氫鈉；F12NaHCO31.18g/L;DMEM/F12NaHCO32.56g/L。

HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養條件下，細胞培養瓶的蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。注意CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege四、相對濕度水盤蒸發面積大，增強蒸發作用，使培養箱內能快速達到飽和濕度狀態。無菌蒸餾水，定期檢查、定期更換。二氧化碳培養箱停止使用時，除水，否則發霉。

CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege五、防污染和消毒滅菌空氣過濾：HEPA過濾器能過濾培養箱內空氣，可過濾除去99.97%的0.3微米以上的顆粒，箱體關閉后5分鐘內達到空氣100級。乙醇消毒。紫外消毒：紫外消毒能力是與紫外燈距離目標的距離的二次方成反比，距離越遠，消毒能力越差，且無穿透能力，難以達到徹底滅菌的要求；高溫濕熱：目前比較有效消毒滅菌的方法，高溫消毒又分為兩類，一是傳統的高溫干熱消毒，另一種是先進的高溫濕熱滅菌。CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege六、重要提示需要定時更換的部件：HEPA過濾器、空氣過濾器

需要定時處理的工作：消毒、水盤

CO2培養箱使用注意事項WenzhouMedicalCollege

▲幻燈片3細胞培養室WenzhouMedicalCollegeBiotechnologyResearchPlatform細胞培養室WenzhouMedicalCollege無菌級別：萬級，局部100級Nikon

倒置生物顯微鏡NikonDS-5M-L1顯微攝影系統Thermo二氧化碳培養箱Labsystems

BioMate電動移液器細胞培養室使用注意事項WenzhouMedicalCollege

細胞培養室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時和幾個操作間相通。操作間放在內間，主要供無菌操作和細胞培養，房間應不受日光直射，大小適當，高度適宜(2.5m)。房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；頂部過高會影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應光滑無死角，以便清洗和消毒。

細胞培養室使用注意事項WenzhouMedicalCollege細胞培養室的日常維護和操作規程：㈠、日常維護1、定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水擦地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰

來蘇爾或者新潔爾滅擦拭。2、無菌室實驗前滅菌：打開紫外燈、空氣凈化器系統30分鐘。3、無菌室實驗后滅菌：用75％酒精擦拭超凈臺（有機玻璃面板不能用酒精擦拭）、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺，打開紫外燈照射30分鐘。細胞培養室使用注意事項WenzhouMedicalCollege㈡、進入無菌室的實驗人員無菌準備：

1、肥皂洗手，75％酒精泡手。

2、帶好手套、穿好隔離衣、拖鞋、帶好隔離帽、口罩。

3、用75％酒精棉球擦凈雙手（酒精不可過多，防止著火）。細胞培養室使用注意事項WenzhouMedical

College㈢、無菌室內的操作要求和注意事項：1、凡是帶入無菌室的試劑（酒精、PBS、培養基、胰蛋白酶等）的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面。2、動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸、手。3、吸取兩種以上的試劑時要注意更換吸管，防止交叉污染。4、不同細胞培養瓶（板）內使用的吸管要注意更換，防止污染擴大。細胞培養室使用注意事項WenzhouMedicalCollege誤區：紫外燈消毒滅菌時間。消毒的效能與距離成反比，進行空氣消毒時燈管應距地面2．5m以內；臺面的消毒應在80cm以內；培養器皿的消毒在30cm以內。消毒的時間與效能存在一定關系，但不是絕對的：照射20min后，有71％的細菌被消滅；40min后79％的細菌被消滅；60min后86％的細菌被消滅。紫外線照射時間再長也不是100％的滅菌，最多只能把90％的細菌消滅，過長的照射是沒有意義的。如用于紫外線照射帶菌的器皿，應與其他消毒方法結合使用，如先用75％的酒精浸泡，再照紫外線消毒滅菌等。細胞培養室使用注意事項WenzhouMedicalCollege誤區：鼓風機風速要適當。超凈工作臺注意過濾器的效果，一般2-3年更換一次，以保持過濾器的凈化效果。

廢液缸處理。

及時關閉空氣循環器

及時關閉空調光學顯微鏡的使用

李東生物學實驗教學中心—、普通光學顯微鏡顯微鏡的構造主要分為三部分：機械部分、照明部分和光學部分—、普通光學顯微鏡

顯微鏡清晰度決定于放大倍數和顯微鏡的分辨力，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定于光的波長和鏡口率以及介質的折射率，用公式表示為：R=0.61λ/N.A，N.A＝ｎsinα/2介質的折射率:空氣(1)水(1.33)香柏油(1.515)

光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。對于干燥物鏡來說，介質為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000X。二、熒光顯微鏡

二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡濾色片參數

MWU:波長330~385nm高通濾色片：420nm

MWB(藍光激發):波長450~480nm高通濾色片：515nm

觀察綠色熒光的樣品，例：FITC（激發490nm，熒光波長520nm）

EB：激發波長488nm,發射波長620nm

（RNA，DNA：紅色；可進入死細胞）

AOPI：激發波長495nm，發射波長530nm

（DNA：綠色；RNA：紅色；可進入活細胞）WIG(綠光激發):波長510~550nm高通濾色片：590nm

觀察紅色熒光的樣品二、熒光顯微鏡熒光顯微鏡和普通顯微鏡的區別：照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上；2.光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；3.有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護人目。三、倒置相差顯微鏡

可以觀察未經染色的標本和活細胞。相差顯微鏡的基本原理是，把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減小，提高反差。三、倒置相差顯微鏡三、倒置相差顯微鏡相差顯微鏡與普通光學顯微鏡的不同點：1、環形光闌位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。2、相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

1、A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。

2.、B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。用ＭＴＴ比色法測定細胞相對數WenzhouMedicalCollege

取有貼壁細胞培養板的，每孔內加入5mg/mlＭＴＴ20μl，4ｈ后每孔加入50%二甲亞砜水溶液150μL，振蕩10Min，570nm(或490nm)處測定OD值，作為細胞相對數。注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege1、在無菌培養皿或6孔細胞培養板中鋪上滅菌后的蓋玻片，在每片蓋玻片上滴一滴計數后的細胞懸液（細胞密度為2×104/ml）。再在每片蓋玻片上滴加培養液至剛好覆蓋滿蓋玻片。將培養皿（6孔細胞培養板）置于37℃，含5%CO2及飽和濕度的

CO2培養箱中培養。2、4小時后將培養液加量至覆蓋整個培養皿的底面。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege3、倒置顯微鏡下觀察，當細胞增殖到合適的密度后取出培養皿中止培養（一般為3-5

天）。

4、傾去培養液，加PBS（PH7.2～7.4）洗滌細胞爬片2次，每次1min。5、加10%中性甲醛（或-20℃預冷的丙酮）固定10～15min。6、吸除固定液，加PBS再洗滌細胞爬片2

次，每次1min。

制備細胞爬片WenzhouMedicalCollege

7、置于室溫下干燥1小時，如暫不染色，先放在-20冰箱中保存。8、取出蓋玻片時注意蓋玻片的正反面（有細胞的為正面）。

細胞爬片的免疫化學染色法WenzhouMedicalCollege

1、在細胞爬片上加0.03%TritonX-100水溶液處理15min。（若是要檢測的抗原表達于胞漿，此步可考慮省略）

2、吸除0.03%TritonX-100，加3%H2O2孵育10min。

3、吸除3%H2O2，加2%牛血清白蛋白封閉30～60min。PBS洗5min。

細胞爬片的免疫化學染色法WenzhouMedicalCollege

4、吸除PBS，分別滴加相應的一抗（用