實驗一細菌的革蘭氏染色和形態觀察球菌桿菌弧菌實驗一細菌的革蘭氏染色和形態觀察一、實驗目的1、掌握無菌操作技術和細菌抹片的制備方法2、學習掌握單染色的操作技術3、了解革蘭氏染色機理，并掌握其操作技術4、熟悉顯微鏡的使用、學習并掌握油鏡的原理和使用方法二、實驗原理---簡單染色細菌的細胞小而透明，在普通的光學顯微鏡下不易識別，必須對它們進行染色。利用單一染料對細菌進行染色，使經染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態和結構。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細菌排列的觀察。

常用堿性染料進行簡單染色，這是因為在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細菌結合使細菌著色。經染色后的細菌細胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍、結晶紫、堿性復紅等。當細菌分解糖類產酸使培養基pH下降時，細菌所帶正電荷增加，此時可用伊紅、酸性復紅或剛果紅等酸性染料染色。二、實驗原理---簡單染色染色前必須固定細菌。其目的有二：一是殺死細菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學固定兩種方法。固定時盡量維持細胞原有的形。二、實驗原理---革蘭氏染色革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家ChristainGram氏創立的，革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細菌學中最重要的鑒別染色法。革蘭氏染色法所以能將細菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細菌細胞壁的結構和組成不同決定的。二、實驗原理---革蘭氏染色革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結晶紫進行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復染劑(如番紅)復染。經此方法染色后，細胞保留初染劑藍紫色的細菌為革蘭氏陽性菌；如果細胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細菌染上復染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。二、實驗原理---革蘭氏染色當用結晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細菌都被染成初染劑的藍紫色。碘作為媒染劑，它能與結晶紫結合成結晶紫一碘的復合物，從而增強了染料與細菌的結合力。當用脫色劑處理時，兩類細菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要由肽聚糖形成的網狀結構組成，壁厚、類脂質含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時細胞壁脫水、使肽聚糖層的網狀結構孔徑縮小，透性降低，從而使結晶紫-碘的復合物不易被洗脫而保留在細胞內，經脫色和復染后仍保留初染劑的藍紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當脫色處理時，類脂質被乙醇(或丙酮)溶解，細胞壁透性增大，使結晶紫-碘的復合物比較容易被洗脫出來，用復染劑復染后，細胞被染上復染劑的紅色。。三、實驗器材

1、菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜面菌種。2、顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、酒精燈、接種環、吸水紙、蓋玻片、試管、水浴鍋。3、草酸銨結晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、0.5%番紅色液、蒸餾水、雙層瓶（香柏油和二甲苯）。四、實驗方法和步驟細菌的簡單染色1、涂片：用1%鹽酸清潔玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸餾水，再用無菌操作的方法挑菌少許于玻片的水中，并充分混勻涂成薄膜。2、干燥：將涂片置火焰高處微熱烘干或自然干燥。3、固定：涂面朝上，通過微火2-3次。4、染色：待玻片泠卻后加結晶紫1-2滴于涂片上，覆蓋涂面染色1-2分鐘。5、水洗：傾去染色液，用水自玻片一端輕輕沖洗至流下的水變無色為止（注：勿沖去菌體）。6、干燥：自然干燥，或用吸水紙吸干。7、鏡檢：油鏡觀察并繪圖。四、實驗步驟1、菌落形態觀察：2、細菌簡單染色：3、細菌革蘭氏染色。注意：菌落顏色、濕度、形狀、大小、透明度、顏色、邊緣是否規則等特征。染色過程：涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→干燥→鏡檢注意事項：涂片：取菌量不能太大干燥：自然干燥水洗：水流不能直接沖在涂菌處滴加少量水挑取菌體涂片干燥固定染色水洗干燥2.革蘭氏染色1）、涂片：取清潔玻片一塊，在玻片兩端1/4處下面用記號筆分別標明S和E（見圖示），并滴一滴蒸餾水，分別將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布在相應的區域內。2.革蘭氏染色2、干燥與固定：方法同（一）中2，3步驟3、染色：

結晶紫染色1-2分鐘--水洗--碘液媒染1-2分鐘--水洗--酒精脫色15-20秒--水洗--番紅復染色2-3分鐘--水洗--干燥--鏡檢記錄。染色結果金黃色葡萄球菌革蘭氏染色結果染色結果大腸桿菌革蘭氏染色結果染色結果金黃色葡萄球菌和大腸桿菌混合菌樣的革蘭氏染色結果四、實驗結果繪圖記錄觀察結果顯微鏡放大倍數＝物鏡放大倍數×目鏡放大倍數

思考題1、在制作涂片中，為什么要進行固定這一步？2、革蘭氏染色中哪一步關鍵，為什么？附：油鏡的使用雙目顯微鏡單目顯微鏡2.油鏡的原理油鏡的透鏡很小，從載玻片透過的光線通過空氣時，因介質折光率不同，光線將發生散射現象，使射入鏡筒的光線很少，物象不清。若在油鏡與玻璃片之間加入與玻璃折射率相近的香柏油，則使通過的光線不至因折射而減弱，因此能清楚地看到物象。雙層瓶香柏油二甲苯實驗報告注意事項1.上課前必須寫好預習實驗報