外植體的接種和培養第一頁，共六十四頁，2022年，8月28日1接種室的消毒無菌操作室的地面、墻壁和工作臺的滅菌可用2%的新潔爾敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外燈照射約20min。使用前用70%酒精噴霧，使空間灰塵落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高錳酸鉀熏蒸。第一節外植體的接種第二頁，共六十四頁，2022年，8月28日2外植體的接種接種：是把經過表面消毒后的植物材料切碎或分離出器官、組織、細胞，并將它們轉放到無菌培養基上的全部操作過程。第三頁，共六十四頁，2022年，8月28日D關紫外燈，開日光燈及風機，擦雙手及臺面E擦拭接種工具并反復灼燒，烘烤培養皿

F接種完，清理臺面并標識B接種前20min打開紫外燈C接種員洗手，在緩沖間換鞋、穿好實驗服A接種前4h接種室滅菌無菌操作第四頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四章外植體的接種和培養

第一節外植體的接種

第二節培養方法第三節培養條件第四節外植體的褐變及其預防措施第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施第五頁，共六十四頁，2022年，8月28日第二節培養方法1固體培養優點:

簡單，應用廣泛，一般只要有培養室及接種箱即可開展工作。缺點:

外植體或愈傷組織只有底部表面接觸培養基，吸收養分，造成各部分營養濃度差異，影響生長。外植體插入培養基后，氣體交換不暢及排泄物質積累，影響組織吸收和造成毒害。受光不均勻，生長不一致。第六頁，共六十四頁，2022年，8月28日2．液體培養分靜止培養和振蕩培養：2.1靜止液體培養優點：培養基中不出現營養物濃度差異的現象，可以用來進行許多營養方面的研究工作。靜止培養不需增添專門設備，適合于某些原生質體培養；第七頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.2振蕩液體培養(1)連續浸沒攪動或振動培養液使組織懸浮于培養基中。培養液的體積約占容器體積的20％，以確保最大的氣相表面，造成較好的通氣條件。

第八頁，共六十四頁，2022年，8月28日大多培養采用搖床：往復式搖床和旋轉式搖床都可用，但以用后者為多。振動速度一般是50-100轉／分。第九頁，共六十四頁，2022年，8月28日(2)定期浸沒組織塊時而在液體中時而在氣體里，這樣既可保證培養基的充分混和，又保證了組織塊呼吸所需的氣體交換。轉床第十頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四章外植體的接種和培養

第一節外植體的接種

第二節培養方法第三節培養條件第四節外植體的褐變及其預防措施第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施第十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第三節外植體的培養條件培養條件包括：光照、溫度、濕度、氧氣和培養基的pH值等。第十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日

1）25±2oC。

2）植株種類及外植體的不同，其最適溫度也是不同的。如百合20℃；月季25-27℃；番茄28℃。低于15C或高于35C，對生長都是不利的?！?溫度第十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日2光照1）光強

★影響外植體細胞的增殖、組織和器官的分化。★有的材料愈傷組織的誘導需光或需暗；★普通培養室要求光照強度1000lx-5000lx?！锕庹諒姡酌缟L健壯；光照弱，幼苗生長弱小，容易徒長。第十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日★不同波長的光對細胞的分裂和器官的分化有影響。2）光質②白光促進小花天竺葵愈傷組織的生長，藍光則無作用。如：①紅光促進楊樹愈傷組織的生長，藍光阻礙其生長。第十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日3）光照時間根據植物生物學特性決定；每日光照12h-16h，第十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日1)pH值5-6.5，一般為5.8，調整用1M的NaOH和HCl溶液。3pH值2)pH影響培養基的硬度。

pH

＞6.0培養基會變硬；

pH

＜5.0培養基不易凝固。3)滅菌之前，培養基的pH要比標準提高0.2－0.3個單位。第十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日4濕度1）瓶內的濕度：主要受到培養基含水量和封口膜透性的影響。如培養基過硬，則不利于外植體接觸和插入培養基，導致生長遲緩；封口膜過于透氣，也會使瓶內濕度下降。第十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日2）環境濕度：

過低會使培養基喪失大量水分，滲透勢升高，影響材料對營養物質的吸收，也會阻礙外植體的生長。一般為70－80%。第十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日5氣體(必要條件)1）培養瓶內氧氣的充足與否與封口材料有關?？捎妹奕蛱刂频姆饪谒芰?。通氣最好的是棉塞，但棉塞易使培養基干燥，夏季易引起污染。第二十頁，共六十四頁，2022年，8月28日2）培養基內氧氣充足與否與培養基的種類和培養方式有關?！艄腆w培養基可加進活性炭來增加通氣度,以利于發根?！粢后w培養時，采取振蕩培養，增加通氣性。

第二十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四章外植體的接種和培養

第一節外植體的接種

第二節培養方法第三節培養條件第四節外植體的褐變及其預防措施第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施第二十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四節外植體的褐變及其防止褐變：是指外植體在培養過程，自身組織從表面向培養基釋放出褐色物質，以致培養基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。第二十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日1褐變的原因2影響褐變的因素3褐變的預防措施第二十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日1褐變的原因褐變的發生與外植體組織中所含的酚類化合物和多酚氧化酶有關。通常酚類化合物和多酚氧化酶分隔存在，比較穩定。當切割外植體后，切口附近的分隔作用破壞，酚類與多酚氧酶接觸，在多酚氧化酶的催化下酚類迅速氧化成褐色的醌類物質和水，醌類又會在酪氨酸酶等的作用下，與外植體組織中的蛋白質發生聚合，進一步引起其他酶系統失活，從而導致組織代謝紊亂，生長停滯，最終衰老死亡。第二十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日2影響褐變的因素

2.1．植物材料2.2．培養條件2.3．培養基2.4．材料轉瓶周期第二十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.1植物材料（1）基因型

不同種植物，同種植物不同類型、不同品種在組織培養中褐變發生的頻率、嚴重程度都存在很大差別。木本植物一般比草本植物容易發生褐變。木本植物木質素、單寧含量或色素含量高。而酚類的糖苷化合物是木質素、單寧和色素的合成前體。第二十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日（2）材料年齡

幼齡材料一般都有比成齡材料褐變輕的趨勢。幼齡材料褐變較輕與其酚類化合物含量少有關。（3）取材部位

分生部位接種后醌類物質形成少；而分化部位接種后醌類物質形成多。第二十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日（4）取材時期多酚氧化酶活性和酚類含量基本對應，春季較弱，隨著生長季節的到來，酶活性逐漸增強。莖尖太小很容易發生褐變。取外植體時還要考慮其粗度，細的可切短些，粗的可切得長些。（5）外植體大小及受傷害程度第二十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日2影響褐變的因素

2.1．植物材料2.2．培養條件2.3．培養基2.4．材料轉瓶周期第三十頁，共六十四頁，2022年，8月28日光照與溫度。溫度過高或光照過強，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速外植體的褐變。2.2．培養條件第三十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日（1）培養基狀態

液體培養基可有效克服外植體褐變。在液體培養基中，外植體溢出的有毒物質可以很快擴散，因而對外植體造成的傷害較輕。2.3培養基第三十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日在初代培養時，培養基中無機鹽濃度過高，酚類物質將會大量外溢，導致外植體褐變。原因：無機鹽中的有些離子，如Mn2+、Cu2+是參與酚類合成與氧化酶類的組成成分或輔因子。（2）無機鹽第三十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日（3）植物生長調節物質

黑暗條件下，生長調節物質的存在會影響褐變，此時去除生長調節物質可減輕褐變。細胞分裂素6-BA或KT不僅能促進酚類化合物的合成，而且還能刺激多酚氧化酶的活性。生長素類如2，4-D和IAA可延緩酚類化合物的合成，減輕褐變現象發生。第三十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日（4）抗氧化劑

抗氧化劑可改變外植體周圍氧化還原電勢，從而抑制酚類氧化，減輕褐變。常用抗氧化劑：半胱氨酸、VC、硫代硫酸鈉等。

第三十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日（5）吸附劑

活性碳和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為吸附劑可以去除酚類氧化造成的毒害效應，第三十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日（6）pH值培養基的pH值較低時，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，從而抑制褐變。而pH值升高則明顯加重褐變。第三十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日2影響褐變的因素

2.1．植物材料2.2．培養條件2.3．培養基2.4．材料轉瓶周期第三十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日2.4．材料轉瓶周期

對于易褐變的材料，接種后轉瓶時間長，傷口周圍積累醌類物質增多，褐變加重，以致全部死亡。縮短轉瓶周期可減輕褐變。第三十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日1褐變的原因2影響褐變的因素3褐變的預防措施第四十頁，共六十四頁，2022年，8月28日3褐變的預防措施3.1．選擇適宜的外植體

外植體應選擇分生能力較強的材料。如采用實生苗莖尖、枝條頂芽、幼胚等材料培養褐變程度比較輕。3.2．采用適宜的培養基和光溫條件

培養基的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平、溫度適宜及在黑暗條件下培養，或在取外植體之前對母株進行遮光處理20d～40d，可以顯著減輕材料的褐變。第四十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.3．培養基中加活性炭、抗氧化劑和其他抑制劑

0.1%～0.5%的活性炭對吸附酚類氧化物的效果很明顯。加抗壞血酸、血清白蛋白、有機酸、蛋白質、蛋白質水解產物、氨基酸、硫脲、二氨基二硫代甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、氰化鉀、蘇糖二硫醇等抗氧化劑和其他抑制劑，或用它們進行材料的預處理或預培養，可有效地預防醌類物質的形成。第四十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.4縮短轉瓶周期對容易褐變的材料可間隔12～24小時培養后，再轉移到新的培養基上，這樣經過連續處理7～10天后，褐變現象便會得到控制或大為減輕。第四十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四章外植體的接種和培養

第一節外植體的接種

第二節培養方法第三節培養條件第四節外植體的褐變及其預防措施第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施第四十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施1外植體的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗發生的機理5預防玻璃化的措施第四十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日1外植體的玻璃化（vitrification）是指組培苗出現葉、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小腫脹，失綠，葉片皺縮成縱向卷曲，脆弱易碎；葉表皮缺少角質層蠟質，沒有功能性氣孔，不具有柵欄組織，僅有海綿組織；體內含水量高，但干物質、葉綠素、蛋白質、纖維素和木質素含量低的現象。

第四十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第四十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日

2玻璃化苗的危害性由于其組織畸形，吸收養料與光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很難繼續用作繼代培養和擴大繁殖的材料；加上生根困難，很難移栽成活。

第四十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施1外植體的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗發生的機理5預防玻璃化的措施第四十九頁，共六十四頁，2022年，8月28日3玻璃化的原因玻璃化的起因是細胞生長過程中的環境變化。產生因素：主要有激素濃度、瓊脂用量、溫度、離子水平、光照時間、通風條件等。第五十頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.1激素濃度

激素濃度增加尤其是細胞分裂素濃度提高（或細胞分裂素與生長素比例高），易導致玻璃化苗的產生。第五十一頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.2瓊脂濃度

培養基中瓊脂濃度低時玻璃化苗比例增加，水浸狀嚴重，苗向上長。隨著瓊脂濃度的增加，玻璃化苗比例減少，但硬化的培養基影響了養分的吸收，試管苗生長減慢，分蘗亦減少。瓊脂濃度一定要適當。

第五十二頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.3溫度

適宜的溫度可以使試管苗生長良好當溫度低時，容易形成玻璃化苗，溫度越低玻璃化苗的比例越高。溫度高時玻璃化苗減少，且發生的時間較晚。第五十三頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.4光照時間

不同的植物對光照的要求不同，滿足植物的光照時間，試管苗才能生長正常。大多數植物在10h～12h光照下都能生長良好，光照時數大于15h時，玻璃化苗的比例明顯增加。第五十四頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.5通風條件

試管苗生長期間，要求有足夠的氣體交換，氣體交換的好壞取決于生長量、瓶內空間、培養時間和瓶蓋種類。在一定容量的培養瓶內，愈傷組織和試管苗生長越快，越容易形成玻璃化苗。如果培養瓶容量小，氣體交換不良，易發生玻璃化。

第五十五頁，共六十四頁，2022年，8月28日3.6離子水平

植物生長需要一定的礦物質營養；但如果營養離子之間失去平衡，試管苗生長就會受到影響。植物種類不同，對礦物質的量、離子形態、離子間的比例要求不同。如果培養基中離子種類及其比例不適宜該種植物，玻璃化苗的比例就會增加。第五十六頁，共六十四頁，2022年，8月28日第五節試管植物的玻璃化現象及其預防措施1外植體的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗發生的機理5預防玻璃化的措施第五十七頁，共六十四頁，2022年，8月28日4玻璃苗發生的機理4.1乙烯的作用Kevers等、張洪勝等認為在試管苗玻璃化過程中，作為內源激素的乙烯從代謝調節上起關鍵性啟動作用。乙烯的產生則取決于培養環境中的脅迫條件，如水勢不當，通氣不暢（造成缺氧）及培養基用BA量過高等，均會導致乙烯產生。乙烯產生后引發了其他激素質和量上的改變及酶類的變化。發生蛋白質、纖維素和木質素的合成障礙及降解，葉綠素分解黃化，逐漸形成玻璃化癥狀；第五十八頁，共六十四頁，2022年，8月28日4.2植物光呼吸途徑和磷酸戊糖途徑與玻璃苗的產生密封瓶口、高溫、高濃度細胞分裂素等因子加快了生長速度，加劇了瓶中氣體組成的改變。磷酸戊糖途徑的中間步驟與戊糖化合物代謝有關（如核酸合成），也與木質素形成有關。當磷酸戊糖途徑被抑制時，壁的再生受抑制，戊糖化合物減少，核酸、蛋白質合成受阻。當光呼吸途徑被抑制時，減弱了光呼吸對光合的保護作用，過剩的同化物損壞了光合細胞器，不僅降低了光合作用，同時也阻礙了乙醇酸的轉化，加重了乙醇酸對植物的毒