本章內容單克隆抗體概念、特性、與多克隆抗體的異同點？雜交瘤技術的基本原理雜交瘤細胞的克隆方法單克隆抗體的制備流程和應用第一頁，共四十四頁。概念多克隆抗體（PcAb）：針對抗原不同表位的多個B淋巴細胞克隆產生的混合抗體單克隆抗體（McAb）：只針對抗原單一表位的B淋巴細胞克隆產生的同源抗體第二頁，共四十四頁。為何要使用單克隆抗體？一個抗原分子可能含有許多抗原表位一個B細胞只會生產一種抗體傳統抗血清對相似抗原會有交叉反應性第三頁，共四十四頁。一個抗原分子上常有許多表位抗原分子上可以誘導出抗體的部位或片段，稱為eptope、antigenicdeterminant；一個抗原分子上通常都有許多eptope，每個eptope至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別針對這些不同的eptope。第四頁，共四十四頁。一個B細胞只會生產一種抗體

血清中的每一種抗體是由單一種B細胞所分泌產生，若能把此B細胞由脾臟中挑出來，單獨培養成細胞株，則可獲得單一種類的抗體，只會對一種eptope反應。大量培養此細胞株，即可有品質一定、純度均一的抗體，即單克隆抗體。第五頁，共四十四頁。抗血清對相似抗原會有交叉反應性對于分子構造相似的抗原，由于它們含有共同或相似的eptope，所產生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產生反應，稱為交叉反應性。同時又由于免疫動物的個體差異，對抗原的反應也有相當的差異，以致無法準確控制所得到每批抗血清效價的高低第六頁，共四十四頁。抗血清和單克隆抗體制備

第七頁，共四十四頁。B細胞無法在培養基中生長

B細胞不易在培養基中生長，雖然有人一直努力，想找出在體外培養脾臟細胞的條件，但結果均不甚理想。(見圖中央的4號B細胞，X表示無法培養)第八頁，共四十四頁。腫瘤細胞可在培養基中永久生長

腫瘤細胞可在培養基中永久生長：若把瘤細胞永久生長的特性，利用細胞融合技術導入可生產抗體的B細胞中，則得到可在培養基中永久生長的B細胞株，即雜交瘤細胞株。

第九頁，共四十四頁。

1975年Koehler和Milstein在Nature雜志聯名發表題為“分泌預定特異性抗體的融合細胞持續培養“的論文，宣告單克隆抗體的誕生，該成果獲1984年諾貝爾醫學獎和生理獎.

第十頁，共四十四頁。雜交瘤技術制備單克隆抗體第十一頁，共四十四頁。雜交瘤技術的基本原理

雜交瘤技術是將能夠產生抗體，但在體外不能進行無限繁殖的B淋巴細胞與能在體外進行無限繁殖，但不能產生抗體的骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞具有兩種親本細胞的特性：既能夠分泌特異性的抗體，又能夠在體外長期繁殖。雜交瘤細胞經過篩選、克隆化培養后成為單個細胞克隆，分泌的抗體即為單克隆抗體。

第十二頁，共四十四頁。單克隆抗體制備流程圖第十三頁，共四十四頁。親本細胞的選擇與制備細胞株穩定，易傳代培養；細胞株本身不產生Ig是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉換酶缺陷株(hypoxanthine-guaninephosphoribosyltransferase,HGPRT)最常用的骨髓瘤細胞是NS-1和SP2/0細胞株骨髓瘤細胞(NS-1)骨髓瘤細胞需定期用8-氮鳥嘌呤(8-AG)處理第十四頁，共四十四頁。親本細胞的選擇與制備免疫脾細胞：是經過抗原誘導活化的免疫細胞，具有分泌抗體的能力

8-12周齡BALB/c小鼠先以目標抗原(如菌體)免疫，抗原需加佐劑(adjuvant）注入小鼠體內慢慢釋出，誘使B細胞成熟增殖并生產抗體。試采血確定有抗體產生后，即可取出

脾臟以收集脾臟細胞(大多為B細胞)與骨髓瘤細胞進行細胞融合。

注意乳劑的生產要完全，可取小量滴入水中，震動后應該不會散去。

有人打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。但除非抗原來源困難或有其它目的，我們仍采用傳統方法，因免疫反應的啟動機制非常復雜，生物整體的免疫反應是最可靠的。

第十五頁，共四十四頁。第十六頁，共四十四頁。第十七頁，共四十四頁。第十八頁，共四十四頁。第十九頁，共四十四頁。細胞融合小鼠脾細胞B

與NS-1細胞N

以PEG

進行融合，操作在2min內完成。PEG可導致細胞膜上脂類物質的物理結構重排，使細胞膜容易打開而有助于細胞融合。第二十頁，共四十四頁。

第二十一頁，共四十四頁。第二十二頁，共四十四頁。常見的幾種融合形式第二十三頁，共四十四頁。細胞DNA合成途經第二十四頁，共四十四頁。HAT選擇培養基三種關鍵成分：

次黃嘌呤（hypoxanthine,H）

氨基蝶呤（aminopterin,A）

胸腺嘧啶（thymidine，T）◆是根據細胞內嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途徑設計的用于篩選雜交瘤細胞的特殊培養基。

第二十五頁，共四十四頁。

葉酸參與DNA合成過程，而氨基蝶呤是葉酸的拮抗劑，能阻斷該合成途徑。◆HAT培養基中含有葉酸拮抗劑-氨基蝶呤，故所有細胞DNA合成的主要途徑均被阻斷，只能通過替代途徑合成。◆雜交瘤細胞從脾細胞中獲得HGPRT，同時又繼承了骨髓瘤細胞長期生長繁殖的特性，能夠在HAT培養基中得以生存而被篩選出來。第二十六頁，共四十四頁。核苷酸從頭合成途徑（denovosynthesis）核苷酸氨基碟呤（A）HAT核苷酸補救合成途徑（salvagesynthesis）次黃嘌呤（H）胸腺嘧啶核苷（T）DNA第二十七頁，共四十四頁。篩選方法初步篩選：融合后馬上以HAT培養，能活下來的都是B細胞與NS-1的正確融合細胞，但此時細胞的遺傳背景尚未十分穩定。

篩選特異性抗體：

并非所有B細胞都會產生我們所要的抗體，小鼠原先就存在許多B細胞株對抗一般疾病；因此要用酶聯免疫分析法（ELISA）挑出特異性抗體第二十八頁，共四十四頁。第二十九頁，共四十四頁。陽性雜交瘤細胞的克隆化克隆化

從抗體陽性孔中分離出單個細胞進行培養，使之繁殖成單一細胞集落的過程。有限稀釋法：最常用的方法顯微操作法熒光激活細胞分選法軟瓊脂平板法第三十頁，共四十四頁。

有限稀釋法計數103/ml102/ml10/ml0.5-2/孔第三十一頁，共四十四頁。將陽性孔細胞株稀釋，重新平分到96孔細胞培養板中，以計算使得每孔中只含有一個細胞（例如每mL含有100個細胞，若只要取一個細胞放到一個培養孔中，那你應該吸取多少mL？0.01mL），待其生長成群落后，再次以ELISA篩選特異性抗體。第三十二頁，共四十四頁。克隆化需至少進行3-5次第三十三頁，共四十四頁。陽性雜交瘤細胞的凍存目的：保證雜交瘤細胞不會因污染或過多傳代變異丟失染色體而喪失功能。凍存液：10%-90%小牛血清+10%二甲亞砜（DMSO），1X106-5X106/0.5mL逐步降溫:-800C過夜,再放入液氮第三十四頁，共四十四頁。單克隆抗體生產小鼠體內誘生法：先向小鼠腹腔注射降植烷，一周后把挑選出來的雜交瘤細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然后以針頭收集所產生的腹水，通常可取得15mL左右；腹水中的抗體濃度非常高，每mL可達數mg。

2)體外增量培養法：把雜交瘤細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每mL只得約數mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴(IBSIntegraBioscience:IntegraCelline)。第三十五頁，共四十四頁。第三十六頁，共四十四頁。第三十七頁，共四十四頁。第三十八頁，共四十四頁。單克隆抗體的性質鑒定Ig類型測定特異性測定效價測定結合表位測定親和力測定染色體分析第三十九頁，共四十四頁。第四十頁，共四十四頁。單克隆抗體的特性高度特異性高度的均一性和可重復性弱凝集反應和不呈現沉淀反