會計學1第11章生物素親合素放大技術生物素（biotin,B）是一種小分子生長因子,又稱維生素H或輔酶R動、植物組織中廣泛分布,卵黃和肝含量高MW244.31kD.I環為咪唑酮環，可與親合素結合Ⅱ環為噻吩環，C2上戊酸側鏈的未端羧基是結合生物大分子的唯一結構

I咪唑酮環

Ⅱ噻吩環

羧基第一節生物素理化性質與標記第1頁/共49頁一、活化生物素生物素側鏈的末端羧基經化學修飾后制成帶各種活性基團的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)第2頁/共49頁生物素活化活化生物素易與抗原、抗體酶及核酸分子中相應基團偶聯形成生物素化標記物標記蛋白質氨基的活化生物素標記蛋白質醛基的活化生物素標記蛋白質巰基的活化生物素標記核酸的活化生物素第3頁/共49頁CNHNHCHCH2CHCHOS(CH2)4COOHNH2COCH2CH2CONHOHCOONCOOCCH2CH2EDC標記蛋白質氨基的活化生物素生物素N-羥基丁二酰胺碳二亞胺生物素羥基琥珀酰亞胺酯（BNHS）第4頁/共49頁活化生物素BNHS分子可與蛋白質賴氨酸的氨基形成肽鍵BNHS適用標記抗體和中性或偏堿性的蛋白質如何減小空間位阻？長臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羥基丁二酰亞胺之間添加了兩個6-氨基已糖分子基團，形成連結臂，生物素與大分子基團的距離第5頁/共49頁標記蛋白質醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼與生物素的合成物主要用于標記偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)

：生物素與賴氨酸連接后，再與無水肼反應而成。除醛基外，BCHZ還可標記氨基第6頁/共49頁標記蛋白質巰基的活化生物素馬來酰亞胺-丙酰-生物胞素（MPB)能特異地與蛋白質巰基結合的活化生物素第7頁/共49頁標記核酸的活化生物素光敏生物素(photobiotin)

側鏈上連接的芳香基疊氮物基團,經光照后,變為芳香基硝基苯，可直接與腺嘌呤氨基結合,形成B-核酸探針

N3NO2NH(CH2)3N(CH2)3CH3NHC(CH2)4SNHNHO第8頁/共49頁生物素脫氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）

作為TTP的結構類似物，可采用缺口移位法摻入到雙鏈DNA中。BNHS和BHZ

可直接標記核酸，但對堿基配對有影響。第9頁/共49頁活化生物素通過側鏈與蛋白分子連接；一個蛋白分子可被多個生物素標記－多價性；對BNHS多標記抗體,BHZ則多標記微酸性抗原；抗原、抗體標記后活性不變；可對標記材料（如酶）標記：堿性磷酸酶標記后活性將降低；二、生物素標記蛋白質第10頁/共49頁選擇活化生物素：依抗原或抗體分子所帶可標記基團的種類（氨基、醛基或巰基）以及分子的酸堿性；控制生物素：蛋白質比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜為2:1,IgG應用濃度

0.5~5μg/ml;

生物素1~3個/Ag，3~5個/Ab；使用交聯臂減少空間阻力第11頁/共49頁第二節親合素、鏈霉親合素的理化性質與標記

親合素(avidin,AV)和鏈霉親合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特異性結合物。而且，二者均為大分子蛋白，因此幾乎所有用于標記的物質均可以同親合素（AV）或鏈酶親合素（SA）結合。第12頁/共49頁結構

四亞基糖蛋白四肽鏈蛋白無糖基PI

10.56結合位

色氨酸色氨酸生物素

44Ka

10151015活性

13～1515～18親合素（A）鏈霉親合素(SA)一、理化特性第13頁/共49頁二、親合素/鏈霉親合素標記標記物：小分子示蹤物125I、膠體金、熒光素、化學發光物大分子物質如酶抗原、抗體親和素的標記：HRP的標記改良過碘酸鈉法戊二醛法第14頁/共49頁過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2AvidinOOONNAvidinAvidinH2ONAvdinNaBH4Schiff堿酶-五炭糖環第15頁/共49頁戊二醛法酶－NH2親和素－NH2＋(CH2)3CHOCHO(CH2)3CHN酶CHN親和素第16頁/共49頁B-E+AABC2.親和素－生物素化HRP復合物的制備第17頁/共49頁鏈霉親和素的標記方法：過碘酸鈉法HRP+NaIO4+SA透析+KBH4

沉淀第18頁/共49頁過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2SAvidinOOONNSAvidinSAvidinH2ONAvdinKBH4Schiff堿酶-五炭糖環第19頁/共49頁第三節生物素-親合素系統的特點一、靈敏度高二、特異性強三、穩定性好四、適用性廣五、其他第20頁/共49頁第四節生物素-親合素系統的應用生物素與親合素之間結合的親合力高、特異性強，各自均可以與各型大小分子結合，以及二者在結合反應時具有的多級放大作用等優越性，使BAS及其相關技術被廣泛應用在各種標記免疫分析技術領域中，尤其為標記免疫檢測自動化分析做出了極大的貢獻。

第21頁/共49頁一、生物素-親合素系統基本類型及原理BAB法：

Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E

特點：以游離A分別連接B-Ab和B-E第22頁/共49頁+A+A第23頁/共49頁ABC法⑴A+B·EA-B·E----ABC⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特點:將BAB法中的A先與B-E結合，制備成復合物ABC第24頁/共49頁++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-B+ABCAb-Ag-Ab-B-ABC第25頁/共49頁BA法Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A·E特點：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省卻了加B-E的步驟第26頁/共49頁

Ag-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E第27頁/共49頁BAS實驗方法及反應層次方法反應層次直接法BAAg-(Ab-B)-A*BABAg-(Ab-B)-A-B*ABCAg-(Ab-B)-AB*C間接法BAAg-Ab1-(Ab2-B)-A*BABAg-Ab1-(Ab2-B)-A-B*ABCAg-Ab1-(Ab2-B)-AB*C第28頁/共49頁二、生物素-親合素系統在酶免疫測定中的應用BAS在ELISA中的應用生物素-親合素系統在均相酶免疫測定

第29頁/共49頁AB固相化抗原或抗體BY第30頁/共49頁電化學發光免疫測定示意圖第31頁/共49頁用于終反應的放大第32頁/共49頁三、生物素-親合素系統在熒光免疫技術中的應用BAS用于熒光抗體技術，通常采用BA法，即用熒光素直接標記親合素（或鏈酶親合素）；也可采用游離親合素（或鏈酶親合素）搭橋，兩端分別連接生物素化抗體和熒光素標記的生物素（BAB法）或熒光標記的抗親合素（或鏈酶親合素）抗體的夾心法。

第33頁/共49頁四、生物素-親合素系統在放射免疫測定中的應用BAS主要與免疫放射分析(IRMA)檢測體系偶聯，用于對終反應的放大（BA法）BAS也可用于IRMA反應后B、F成分的分離第34頁/共49頁五、生物素-親合素系統在分子生物學中的應用以生物素標記核酸探針進行的定位檢測用BAS制備的親和吸附劑進行基因的分離純化將免疫測定技術與PCR結合建立免疫-PCR(immuno-PCR)用于抗原的檢測第35頁/共49頁Anti-HCVSandwichprinciple.Totalduration:18minutes.1stincubation:40μLofsample,60μLofreagentcontainingbiotinylatedHCVantigensand60μLofareagentcontainingHCVantigenslabeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcomplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepetavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiontinandstreptavidin.第36頁/共49頁Thereactionmixtureisaspiratedintothemeasuringcellwherethemicroparticlesaremagneticallycapturedontothesurfaceoftheelectrode.UnboundsubstancesarethenremovedwithProCell.Applicationofavoltagetotheelectrodetheninduceschemiluminescentemissionwhichismeasuredbyaphotomultiplier.ResultsaredeterminedautomaticallybytheElecsyssoftwarebycomparingtheelectrochemiluminescencesignalobtainedfromthesamplewiththecutoffvalueobtainedbyanti-HCVcalibration.第37頁/共49頁HBsAgIISandwichprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:50μLofsample,twobiotinylatedmonoclonalanti-HBsAgantibodies,andamixtureofmonoclonalanti-HBsAgantibodyandpolyclonalanti-HBsAgantibodieslabeledwitharutheniumcomplexformasandwichcomplex.2nd:incubation:Afteradditionofstreptavidin-coatedmicroparticles,thecomplexbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第38頁/共49頁Anti-HBeCompetitionprinciple.1st:incubation:Anti-HBeinthesample(35μL)bindstotheaddedHBeAg.2ndincubation:Afteradditionofbiotinylatedantibodiesandrutheniumcomplex-labeledantibodiesspecificforHBeAg,togetherwithstreptavdin-coatedmicroparticles,thestill-freebindingsitesontheHBe-antigensbecomeoccupied.Theentirecomplexisthenboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavdin.第39頁/共49頁Anti-HAVIgMμ-Capturetestprinciple.Totaldurationofassay:18minutes.1stincubation:Pretreatmentof10μLoftheautomatically1:400dilutedsample(usingElecsysDiluentUniversal)withanti-Fdyreagenttoblockspecificinthepresenceofthemonoclonalanti-HAVantibodieslabeledwithrutheniumcomplex.第40頁/共49頁2ndincubation:Afteraddionofbiotinylatedmonoclonalh-IgM-specificantibodies,HAVantigen,andstreptavdin-coatedmicroparticles,theanti-HAVIgMantibodiespresentinthesampleformasandwichcomplexwiththeHAVantigenandtheruthenium-labeledanti-HAVantibodywhichbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinandstreptavidin.第41頁/共49頁Anti-HBsSandwichprinciple.1stincubation:Anti-HBsinthesample(40L),biotinylatedHBsAg(ad/ay),andHBsAg(ad/ay)labeledwitharutheniumcomplexreacttoformasandwichcoplex.2ndincubation:Afteradditionofstrepavdin-coatedmicroparticles,thecomplesbecomesboundtothesolidphaseviainteractionofbiotinan