免疫學檢測技術的基本原理第一頁，共二十七頁，2022年，8月28日一.體外抗原抗體反應的特征

1.高度特異性抗原的表位與抗體的抗原結合點結構互補。

2.可見性抗原與相應抗體結合后能肉眼直接觀察。二.抗原抗體反應的影響因素

1.溫度：最適溫度為37℃。

2.酸堿度：最適pH=6-8。

3.電解質：可促進抗原與抗體的結合。常用生理鹽水。第二頁，共二十七頁，2022年，8月28日抗原抗體比例對反應現象的影響第三頁，共二十七頁，2022年，8月28日三.檢測抗原和抗體的體外試驗（一）凝集反應

顆粒性抗原（RBC、細菌等）與相應抗體結合形成肉眼可見凝集物的現象或反應。

1．直接凝集試驗（1）玻片凝集試驗：用于定性測抗原。如ABO血型鑒定，細菌的鑒定、分型等。（2）試管凝集試驗：用于定量測抗體如肥達氏反應。

2．間接凝集試驗如類風濕因子的測定等。第四頁，共二十七頁，2022年，8月28日第五頁，共二十七頁，2022年，8月28日（二）沉淀反應

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應抗體結合而形成可見沉淀物的反應。因該類反應多在半固體瓊脂凝膠中進行，故又稱為瓊脂擴散試驗或免疫擴散。

第六頁，共二十七頁，2022年，8月28日1．單向免疫擴散用于定量測抗原。如檢測血清免疫球蛋白、C3等含量。

第七頁，共二十七頁，2022年，8月28日2．雙向免疫擴散主要用于定性檢測抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關性分析。第八頁，共二十七頁，2022年，8月28日3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯低丙種球蛋白血癥等的診斷。

第九頁，共二十七頁，2022年，8月28日

4．免疫比濁用于定量測抗原。該法快速、簡便。5）免疫比濁法

在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經一定時間后形成免疫復合物。用濁度計測量反應液體的濁度，復合物形成越多，濁度越高，繪制標準曲線并根據反應液體的濁度，推算樣品中的抗原含量。第十頁，共二十七頁，2022年，8月28日（三）免疫標記技術

用熒光素、同位素或酶等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。標記物質與抗體（或抗原）的化學連接未改變抗體（或抗原）的免疫學特性，且極大的提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術主要有三種基本類型：

免疫熒光技術免疫酶技術同位素標記技術

第十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日1．免疫熒光技術(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應，，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發出熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。

（1）常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。（2）方法*直接熒光法：

優點--特異性強缺點--每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。*間接熒光法優點--敏感性比直接法高，且制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測，缺點--非特異性熒光增加。第十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十三頁，共二十七頁，2022年，8月28日第十四頁，共二十七頁，2022年，8月28日2．酶免疫測定（EnzymeImmunoassay,

EIA）用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應。EIA將抗原抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用于底物后顯色來判定結果。其檢測的敏感度可達pg-ng/ml水平。

Ab+EAbE

Ag+AbEAgAbE+底物

呈色反應第十五頁，共二十七頁，2022年，8月28日EIA第十六頁，共二十七頁，2022年，8月28日（1）標記的酶：辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。（2）常用方法:A酶聯免疫吸附試驗

(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA)

將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除.

用于可溶性抗原和抗體的檢測。

第十七頁，共二十七頁，2022年，8月28日*

間接法：用于檢測抗體第十八頁，共二十七頁，2022年，8月28日*

雙抗體夾心法：用于檢測抗原。第十九頁，共二十七頁，2022年，8月28日B免疫組化技術—檢測組織中或細胞表面的抗原。

對抗原進行定性、定量、定位檢測。

C酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）

可用于細胞因子的檢測第二十頁，共二十七頁，2022年，8月28日3．放射免疫測定法（RIA）

敏感度可達pg水平，其標記物為125I、131I等。常用于微量物質的檢測，如激素、IgE等。

第二十一頁，共二十七頁，2022年，8月28日4．化學發光免疫分析

該法是將發光物吖啶酯、或魯米諾標記抗原或抗體進行的結合反應。

發光物質在反應劑激發下生成激發態中間體，當激發態中間體回到穩定的基態時發射出光子，用自動發光分析儀能接收光信號，測定光子的產量，以反映待檢樣品中抗體或抗原的含量。其靈敏度高于RIA，常用于超微量物質的測定，如甲狀腺素等。第二十二頁，共二十七頁，2022年，8月28日5．免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測技術，即將電泳分區的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術測定。常用于檢測多種病毒的