《生物技術概論》(研究生)全冊配套完整課件生物技術概論

課程安排生物技術緒論

重組DNA技術與基因工程細胞工程與組織工程蛋白質和酶工程微生物發酵和分離純化工程合成生物學轉基因技術PCR及各種基因擴增技術*生物芯片技術*高通量基因測序技術*蛋白質組學和代謝組學技術生物技術應用農業、人類健康、食品、環境能源、司法考古等*也是今天的講課的主要提綱課程目標：廣義的最新的生物技術對今后科研有所幫助為了今后造福人類不斷學習生物新技術什么是生物技術？

生物技術（biotechnology）,有時也稱生物工程（bioengineering）,是指人們以現代生命科學為基礎，結合其他基礎科學的原理，采用先進的科學技術手段，按照預先的設計改造生物體或加工生物原料，為人類生產出所需產品或達到某種目的。生物技術是人們利用微生物、動植物體對物質原料進行加工，以提供產品來為社會服務的技術。

現代生物技術綜合生物化學、遺傳學、細胞生物學、胚胎學、免疫學、化學、物理學、信息學、計算機等多學科技術，發展到高通量組學（omics）芯片技術、基因組人工設計與合成生物學等技術。緒論

B&B生物學科的三個專業

生物科學生物技術生物工程一段時期，生物技術與生物工程相互代替；但是在不少高校，生物技術與生物科學相似，生物工程與生物技術隸屬不同學科。我的理解：科學問題----生物科學（基礎）技術應用----生物技術（廣泛）

工程化應用---生物工程（部分）技術發展對科學的推動作用工欲善其事，必須先利其器，磨刀不誤砍柴工科學技術是第一生產力顯微鏡、基因重組技術、基因測序、PCR單克隆抗體、微生物發酵生命科學是實驗科學，必須掌握各種實驗技術：5個層次，分子，細胞，組織，個體，群體

生物技術對人類社會的作用古老，不知不覺在應用：發酵，種植，養殖，馴化基因工程：新的標志，企業化生產醫藥（藥和診斷），農業（新品種），食品，環境，能源PCR技術：拓展和加速發展其應用生物信息學：軟技術各個學科綜合

生物技術產品在我們身邊生物技術藥物：胰島素，EPO，干擾素等轉基因農產品：轉基因番茄，轉基因大豆，轉基因棉花等轉基因動物：一般只處于實驗室階段基因治療與細胞治療干細胞與組織工程：生物克隆體外診斷試劑：抗體免疫與基因檢測合成生物：各種產品與物種基因工程:生物技術的核心基因工程微生物發酵工程細胞工程蛋白質酶生化工程基因工程20世紀70年代隨著DNA重組技術的出現而發展出來。對基因進行加工，使生物體發展成為新的有機生物體。是生物工程四兄弟中發展最迅速，威力最大的一個。基因工程原理示意圖基因工程的表達系統原核細胞：大腸桿菌真核細胞：酵母細胞、昆蟲(家蠶),哺乳動物細胞生物反應器：轉基因植物(分子農場)、轉基因動物（乳腺生物反應器）

基因是生物醫藥產業的源頭基因

基因診斷基因治療反義RNA免疫學診斷基因工程藥物化學合成藥物設計的靶分子DNA疫苗或核酶等基因工程疫苗安全無毒：無滅能不徹底，泄漏，回復，病原體蛋白毒副作用等。可以大量生產；不受來源限制多價疫苗：同時免疫多種傳染病成本低廉，易于推廣不足：不能完全模仿天然疫苗。蛋白制備純化和保純仍然復雜

基因工程乙肝疫苗

人類歷史上第一種規模化生產、最為成功基因工程疫苗，95年的全球銷售額突破10億美元；美國1986年正式投放市場。全世界乙肝病毒攜帶者78％生活在亞洲國家，約有一半是中國人種，乙肝疫苗的年需求量約7000萬支，并呈上升趨勢。2000年底在中國基因乙肝疫苗全部取代血源乙肝疫苗復旦大學獲得世界上第一張O型口蹄疫基因工程疫苗證書！基因工程藥物天然基因:如促進血細胞生長因子基因衍生物:如腫瘤壞死因子天然重組和融合:導向性干擾素人工篩選和合成:如小肽分子

基因工程疫苗:如乙肝疫苗

基因藥物的優勢IL-2,胰島素，GLP-1，EPO,IFN，EGF……基因工程腫瘤壞死因子單克隆抗體單克隆抗體的導向治療:生物導彈化學藥物,毒素和放射性核數作彈頭和單克隆抗體(瞄準器)偶聯,制成生物導彈.第一代單克隆抗體:鼠源基因工程抗體:抗體的人源化完全人化的單克隆抗體美國批準了10多種單克隆抗體臨床上市!進化論在現代科技中應用-模仿進化

地球上幾十億年的勃勃生機充分展示了進化的無所不能，研究人員從進化中借經驗，利用定向進化來增強蛋白的有用功能。通過誘導基因發生突變，產生相應蛋白，篩選其功能改變蛋白，從中選取表現最好的基因進行新一輪的突變和檢測，如此循環上百萬次。首先，找出用于進化的基因模板池，其次，了解特定基因如何進化。可以改變蛋白上的某個氨基酸，具體位置可以從整條氨基酸鏈上隨機抽取，也可以在某些特定區域內隨機選擇，甚至可以選定已知的、對蛋白功能很重要的某個特定位點。編碼蛋白的基因在結構上由一段段獨立片斷組成，我們可以調換它們的順序，創造出具有新功能的蛋白。我們還可以在一個由系統進化方法確定的基因家族中，或者從姐妹物種中，抽取相關基因的結構片段，混合成所謂的“嵌合蛋白”（chimericprotein）。在自然界中，基因片段的重組和重排使蛋白快速進化；如今這一過程在實驗室中重現，正在向我們顯示它的巨大威力。人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的開發和丙型肝炎疫苗的優化，是定向進化眾多成功案例中比較典型的兩個。在對20多種人干擾素中的基因片段進行重排之后，一種超強嵌合蛋白已經問世，它減慢病毒復制的能力比原有人干擾素強25萬倍。經過改良的人類腫瘤抑制蛋白，在實驗室研究中已經顯示出比原始蛋白更強的腫瘤生長抑制功能。背后的功臣復旦大學與上海醫學遺傳所首次報道了凝血因子IX轉基因牛，引起熱議！在植物中成功表達的藥用蛋白植物的次級代謝藥物的基因調控是另外一個方向“

病毒”也是幸運的使者

基因治療---新的醫藥革命1991年，復旦大學等進行了世界首次血友病B基因治療

遺傳易感性與藥物遺傳學

為什么有些人容易得癌癥，高血壓，糖尿病？為什么同樣的毛病，同樣的治療，療效和毒性千差萬別？SNP(SingleNucleotidePolymorphism)

單核苷酸多態性

是人類基因組中最常見的基因多態性，是個體差異的最基本因素，是功能基因組學、疾病基因組學、藥物基因組學和環境基因組學研究重要內容。DNA損傷修復途徑肺癌肺癌易感性肺癌化療吸煙復旦大學在國際上報道了一批肺癌，肝癌等腫瘤易感基因和化療藥物敏感基因，對于個性化預防和治療具有重要價值ALDH2基因缺陷飲酒臉紅

衛生部臨檢中心批準“硝酸甘油治療急性心絞痛療效檢測方法和試劑盒”硝酸甘油治療心絞痛效果差

該成果申請了國際專利

多家臨檢中心和醫院在應用復旦大學首次報道了ALDH2基因變異導致硝酸甘油治療心絞痛無效環境基因組學

研究物理,化學和生物環境對人體基因組的作用及其易感性.

為什么有人抽煙不得肺癌?而另外一部分人卻敏感異常?**

為什么有些人喝酒海量?而另外一些人一喝酒就醉倒?

為什么有人對艾滋病談笑風生,而一部分人卻談虎色變?基因預測功與過？基因預測疾病風險和指導治療已經在國際上蓬勃開展，其科學性特別是一些公司的經營模式受到質疑？DPD/5Fu,APOE4…97年以來，克隆技術掀起浪潮胚胎干細胞與治療性克隆

造血干細胞真能干！07年以來，iPS最激動人心之技術，長生不老有望！hfat-1TransgenicPigshfat-1轉基因豬富含ω-3多不飽和脂肪酸，能夠預防：癌癥,糖尿病.冠心病，高血壓.風濕關節炎，骨質疏松.憂郁癥,老年癡呆。基因打靶與生物克隆體細胞基因打靶,細胞克隆,制備疾病動物模型;轉基因動物等.無籽西瓜

無籽西瓜的染色體組成，普通西瓜2n＝22

誘變成功的四倍體作母本與二倍體父本雜交，獲得三倍體西瓜，在形成生殖細胞時，不能正常減數分裂，所以成為無籽西瓜。新世紀的綠色革命轉基因植物–棉花轉基因抗蟲棉CK抗蟲CK抗蟲抗除草劑大豆，便于運輸的西紅柿，轉基因金色大米，……2010年華中農大兩抗蟲轉基因水稻獲得農業部頒發的中國首張安全證書少打農藥，少施化肥，抗旱節水，優質高產，

對環境生態長遠作用問題??編碼目的基因表達可能對人體導致的過敏問題??轉基因植物的爭議

調查發現，國內目前發對轉基因的人數超過了贊成者，反對的呼聲一浪高過一浪！克雷文特爾于2010年5月宣布,他們已經創造了一種人工合成的基因組,并且使用基因組表達培養出了第一個具有生命的有機體。打開了”潘多拉”之盒!

免疫診斷單克隆抗體臨床診斷的天下疾病的預測早期,準確診斷,導向診斷,指導治療臨床預后

ELISA，免疫組化，熒光，化學發光，流式細胞儀多種形式單克隆抗體制備技術是診斷領域的革命！也是治療領域的革命基因診斷從遺傳病到腫瘤從Southern到PCR從組織到外周血病毒疾病檢測顯神威基因芯片的誕生DNA指紋神奇的PCR：1變成1000萬“擴增RNA”

的NASBA

技術

引物2逆轉錄酶逆轉錄酶T7RNA聚合酶逆相RNA擴增物RNaseH引物1引物1延伸

RNaseH

和引物2延伸

RNAT7RNA聚合酶逆轉錄酶逆轉錄酶“分子燈塔”雜交AMV-RT(鳥肉瘤病毒逆轉錄酶):延伸形成RNA-DNA雜交鏈RNaseH:降解雜交鏈中的RNAT7-RNA聚合:轉錄形成的RNA轉錄產物

親子鑒定-DNA指紋

通過用限制性內切酶消化和與特異的核心探針（VNTR）雜交取得不同大小的DNA片段的多區帶圖譜，DNA指紋圖被認為對某一個體是獨特的。目前的DNA指紋是指不同的STR特異基因組合,最為常見的是國際通用的15個STR組合。

父親母親子女1子女2子女3未來的基因芯片具有人體特征FISH技術是疾病診斷和治療的重要技術

DNA損傷和突變檢測技術

基因芯片

-------生物芯片的先鋒

液相芯片利用微球標記和流式細胞儀的特性進行中高通量的各種分子檢測，是檢驗領域中的革命！SPR技術分子互作儀也值得關注！測序技術飛速發展，一日千里！錢永健改造綠色熒光蛋白，通過改變其氨基酸排序，造出能吸收、發出不同顏色光的熒光蛋白，其中包括藍色、青色和黃色，并讓它們發光更久、更強烈。

熒光蛋白成為生命科學研究和應用的重要工具生物素與親和素在生物分子相互作用中，生物素和親和素的特異性和牢固性特別受到青睞！蛋白質組學檢測和分析技術蛋白質組學對于疾病機制診斷和治療意義巨大

結構生物學是闡明結構和功能關系的學科,技術性很強！計算可發揮更多作用對于生物機制闡明和藥物開發至關重要！代謝組學作用日益體現

代謝組學是系統研究生物體內各種代謝物質，尤其是小分子代謝物，新陳代謝是生命的基本特征，代謝組學的核心技術包括：

1氣相色譜－質譜聯用(GC/MS)2液相色譜－質譜聯用(LC/MS)3核磁共振(NMR)技術發展日新月異科研的動力在于探求未知的好奇心技術發展的動力除此還有利益驅動！技術發展日新月異！（SNP，測序，芯片）目前我們最缺乏掌握高級技術的人員！我們的科學家甚至不屑技術，CRO中國的研究經費大多耗費在試劑，儀器等技術性產品中！我們最落后的是儀器，是生物技術產業！

“生物經濟”在國民經濟中的地位生物技術催生生物經濟，比爾蓋茨的預言，中國曾經的首富李鋰夫婦；BT&IT

醫藥：從1998年開始，全球生物制藥產業的年銷售額連續10年增長速度保持在15%~33%，成為發展最快的高技術產業之一。2007年基因工程藥物的銷售額已達到840億美元，占整個醫藥產業銷售額的12%左右，并且這一比重逐年遞增。

祝大家

中秋節快樂重組DNA和基因工程

DNARecombinationandGeneticEngineering朱煥章DNA重組接合作用(conjugation)轉化作用(transformation)轉導作用

(transduction)轉座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)位點特異的重組(site-specificrecombination)概念：發生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進行單鏈或雙鏈片段的交換。

以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機制的Holliday模型。一、同源重組Holliday模型中，同源重組主要4個關鍵步驟①兩個同源染色體DNA排列整齊②一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應的鏈連接，形成Holliday中間體③通過分支移動產生異源雙鏈DNA④Holliday中間體切開并修復，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：片段重組體(patchrecombinant)拼接重組體(splicerecombinant)

內切酶

(recBCD)DNA侵擾(recA)分支遷移

(recA)

內切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′目錄Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(ruvC)內切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體目錄二、細菌的基因轉移與重組（一）接合作用當細胞與細胞、或細菌通過菌毛相互接觸時，質粒DNA從一個細胞（細菌）轉移至另一細胞（細菌）的DNA轉移稱為接合作用(conjugation)。可接合質粒如F因子(Ffactor)

質粒——細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子（二）轉化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細胞或培養的受體細胞獲得新的遺傳表型，稱為轉化作用

(transformation)。

例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細菌攝取。（三）轉導作用當病毒從被感染的（供體）細胞釋放出來、再次感染另一（供體）細胞時，發生在供體細胞與受體細胞之間的DNA轉移及基因重組即為轉導作用(transduction)。λ噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysispathway)溶源菌生長途徑(lysogenicpathway)例目錄目錄三、位點特異重組位點特異重組(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點間發生的整合。位點特異性重組不依賴于DNA順序的同源性（雖然亦可有很短的同源序列），而依賴于能與某些酶相結合的DNA序列的存在λ噬菌體DNA的整合λ噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點發生選擇性整合；反轉錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉錄病毒cDNA的長末端重復序列(longterminalrepeat,LTR)。

λ噬菌體的整合和切除

λ噬菌體：attPPOP、

大腸桿菌：attB/attλBOB、

1.整和：BOB、+POP、BOP、+POB、

2.切除：BOP、+POB、BOB+POPIntIHFInt,XisIHF

通過attP和attB間的相互重組，環狀的噬菌體DNA轉換為整合的原噬菌體，原噬菌體通過attL和attR間的相互重組而切除λ的整合作用有兩個特點：①這種交換是可逆的，原先存在的DNA順序全部被保存下來，并無丟失；②噬菌體和細菌的DNA之間有一段很短的同源序列，重組交換必須通過其中的一個特定的核苷酸。這兩個特點也就是位點特異性重組的共同特點BiologicalconsequencesofrecombinationInversionsystem(TheFLP-FRTsystem):The2-microncircularplasmidoftenfoundinyeastencodesaCSSRsystemthatcaninvertalargesegmentofplasmid.Theinversionchangestheorientationofreplicativeforkswithintheplasmidandtherebypromotesamplificationtohighcopynumber.RepforkRepforkRepforkRepforkFRTFLP

Cre重組酶于1981年從P1噬菌體中發現，屬于λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp（EMBL數據庫登錄號X03453），編碼38kDa蛋白質。Cre重組酶是一種位點特異性重組酶，能介導兩個34bp的LoxP位點之間的特異性重組，使LoxP位點間的序列或基因被刪除。

LoxP由兩個13bp的反向重復序列和8bp的中間間隔序列共同組成，8bp的間隔序列同時也確定了LoxP的方向。Cre在催化DNA鏈交換過程中與DNA共價結合，13bp的反向重復序列是Cre酶的結合域Cre重組酶介導兩個LoxP位點間的重組是一個動態、可逆的過程，可以分成三種情況：

1、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；

2、如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位；

3、如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。

FLP-FRTRecombinase:FLPRecombinationsite:FRTFRT:originalFRTR-RSRecombinase:RRecombinationsite:RS13-13-8-1313-8-1312-7-12TherecombinationsitespairinsamedirectionDeletion/IntegrationInversionabcdabcdExchange/TranslocationMutantsitesLE/REmutationLEmutantREmutantSpacerMutationlox511ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATAAReactionsbetweenmutantsitesLEmutantXREmutantLE+REmutant+loxPloxPXlox511lox511Xlox511lox511Xlox512ConditionalTargetingI

Crerecombinase453Cremediateddeletionotherrecombinationsystem:Flprecombinase,frtsites5'-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'loxPsiteCrerecombinase:recombinatingenzymeofthephageP153Cremediatedinversion453453ФC31Int重組特點比基于同源重組原理的基因打靶效率高2-3個數量級比Cre重組酶介導的位點特異整合效率高10-100倍比隨機整合效率高5-10倍以上,且90%的整合事件發生在假attP位點使外源基因穩定有效的整合到哺乳細胞基因組上預定位點的策略成為可能，尤其為在基因治療上應用奠定了基礎。四、轉座重組由插入序列和轉座子介導的基因移位或重排稱為轉座(transposition)。插入序列(insertionsequences,IS)組成：二個分離的反向重復(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重復序列一個轉座酶（transposase)編碼基因

IRTransposaseGeneIR發生形式：保守性轉座(conservativetransposition)復制性轉座(duplicativetransposition)（一）插入序列轉座插入序列的復制性轉座目錄轉座子(transposons)——可從一個染色體位點轉移到另一位點的分散重復序列。

轉座子組成：反向重復序列轉座酶編碼基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）轉座子轉座由轉座子介導的轉座目錄第二節

重組DNA技術DNARecombinationTechnique重組DNA技術的發展史年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉化實驗1973年美國斯坦福大學的科學家構建第一個重組DNA分子1977年美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應用重組DNA技術制造醫學上重要的藥物。1980年開始建造第一家應用重組DNA技術生產胰島素的工廠1997年英國羅林研究所成功的克隆了多莉相關概念DNA克隆工具酶目的基因基因載體基本原理重組DNA技術與醫學的關系本節主要內容一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細胞克隆個體克隆（動物或植物）DNA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。生物技術工程:

基因工程、蛋白質工程、酶工程、細胞工程等目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學。（二）工具酶

限制性核酸內切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆轉錄酶

T4DNA連接酶堿性磷酸酶末端轉移酶

TaqDNA聚合酶重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸內切酶定義限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基因

cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)（四）基因載體定義為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達有意義的蛋白質所采用的一些DNA分子。常用載體質粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質粒

(plasmid)特點能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。目錄λ噬菌體DNA改造系統λgt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列3.粘性質粒(cosmid)酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他二、重組DNA技術基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構建重組體的篩選克隆基因的表達

以質粒為載體的DNA

克隆過程目錄（一）目的基因的獲取1.化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)

*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因目錄限制酶切位點限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫目錄mRNAcDNA雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫反轉錄酶載體受體菌復制*從cDNA文庫獲取目的基因逆轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目錄（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(competent)

導入方式轉化(transformation)轉染(transfection)感染(infection)（四）重組DNA導入受體菌（五）重組體的篩選

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄α互補目錄α互補的檢測目錄原位雜交目錄Southern印跡目錄雞的β肌球蛋白的克隆和檢出目錄重組DNA技術操作過程可形象歸納為小結分分離目的基因切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體轉轉入受體菌篩篩選重組體重組DNA技術操作的主要步驟載體質粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產物限制酶消化開環載體DNA目的基因連接酶重組體轉化體外包裝，轉染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交目錄表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白大鼠胰島素原cDNA的表達和分泌 目錄優點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區域積累缺點：操作技術難、費時、經濟轉染

——將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射

2.真核表達體系

酵母、昆蟲、乳類動物細胞表達載體pFASTBACI的物理圖譜目錄目錄（一）疾病基因的發現與克隆根據基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。三、重組技術與醫學的關系（二）生物制藥

重組DNA醫藥產品產品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂目錄基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷標準.能正確擴增靶基因；.能準確區分單個堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細胞基因治療(germlinegenetherapy)1.產前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防位點特異整合酶系統應用Cre/Loxp系統--ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA2003,35(5):435-440phiC31系統--LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863ConditionalGeneActivationinCulturedHepatocytesUsinga

Ligand-dependentChimericCreRecombinase

ZHUHuan-ZhangCAOYing-YingCHENGGuo-XiangFig.1Thealb-Cre-ERtandZAPexpressionconstructaredepicted

ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA2003,35(5):435-440

Fig.2Identificationofpalb-Cre-ERtrecombinantandPCRanalysisofgenomicDNAfromBRL-ZAPcellsstablyexpressingthelacZreportergene

(A)Identificationofpalb-Cre-ERtrecombinant.1,recombinant-HindIII;2,recombinant-ScaI;3,recombinant-EcoRV;4,Vector-HindIII;M,GeneRuler1kbDNALaddar.(B)PCRanalysisofgenomicDNAextractedfromBRLcellstransfectedwithZAPexpressionvector.1,DNAfromBRL-ZAPcells;2,positivecontrol;3,blankcontrol;4,negativecontrol;M,GeneRuler1kbDNAladdar.

Fig.3ConditionalexpressionofhAPmediatedby4-OHT-inducedCrerecombinase

(A,B)HistochemicalanalysisofhAPexpressionbyhAPstaininginBRL-ZAPcellstreatedwithethanol(A)ortreatedwith4-OHT(B).(C,D)HistochemicalanalysisofhAPexpressionbyX-galandhAPdoublestaininginBRL-ZAPcellstreatedwithethanol(C)ortreatedwith4-OHT(D).AproportionofhAPstainingpositivecellswasobservedonlyinBRL-ZAPcellstreatedwith4-OHT(B,D).Fig.4TimecourseofhAPexpressionandPCRanalysisofCre-mediatedrecombinationinBRL-ZAPcellstreatedwith4-OHT

(A)TimecourseofhAPexpressionmediatedby4-OHT-inducedCrerecombinaseinBRL-ZAPcells.(B)PCRanalysisofgenomicDNAextractedfromBRL-ZAPcellstransfectedwithAlb-Cre-ERtinthepresenceof4-OHT,orethanol,respectively.Afragmentof790bpisobtainedafterrecombinationonlyinthepresenceof4-OHT;M,GeneRuler1kbDNAladdar.Figure1.SequencealignmentofeightmembersincludingphiC31integrasewithinlargeserineintegrasefamily.

LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863PlosONE,2010,5(1)e8863Figure3.

Recombinationassayofthepurifiedwild-typeandmutantphiC31integrasesinitro.

ALiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863Figure

4.AssayofDNAbindingactivityofwild-typephiC31integrase.Afixedamount(16fmol)ofa41bpbiotin-labeledattBfragment(A)ora50bpbiotin-labeledattPfragment(B)wasincubatedwithvaryingamountsofpurifiedwild-typephiC31inbindingbufferat30°Cfor30min.Reactionswereanalyzedbypolyacrylamidegelelectrophoresis(5%polyacrylamide,1xTris-borate-EDTA).Arrowsshowthepositionsoffreeprobe(F)andtheDNAbindingcomplexes(I,IIandIII).

LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863”

LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863Figure8.

CDspectraofwild-typeandmutantphiC31proteins.FarUVspectrafrom190to250nmofwild-typephiC31andmutantsG182A/F183A,C374A,C376A/G377A,Y393A,V566AandV571Awereshown,at25°Cusinga0.02-cmquartzcell.Proteinwasdissolvedin0.15Msodiumchloride,pH7;OtherconditionsweredescribedinExperimentalProcedures.Wtiswild-type.LiuSH,etal.Plosone,2010,5(1),e8863Conclusions:ThisdatarevealsthatsomeofthehighlyconservedresiduesbothintheN-terminusandC-terminusregionofphiC31integrase,playvitalrolesinthesubstratebindingandcleavage.Thecysteine-richmotifandtheC-tailval-richregionofphiC31integrasemayrepresentthemajorDNAbindingdomainsofphiC31integrase.動物克隆技術

一、胚胎工程二、胚胎移植技術三、動物克隆技術四、核移植技術的應用一、胚胎工程1、受精卵胚胎胚胎分裂、著床著床前胚胎－“胚胎”著床后胚胎－“胎兒”胚胎細胞體細胞四細胞囊胚胎兒成體受精卵四細胞囊胚胎兒成體受精兩性配子的結合細胞分裂細胞分化胚層形成和組織發生器官系統新的個體特定基因表達2、動物胚胎學四細胞囊胚胎兒成體受精

輸卵管，輸卵管液

子宮

MammalEmbryoBio-engineering出生

培養箱，培養液

子宮

人造子宮

出生3、動物胚胎工程動物胚胎工程定義

對配子或胚胎進行人為地干預，使其環境因素、發育模式或局部組織功能，發生量和質的變化。這一綜合技術，統稱為胚胎生物工程，或簡稱為胚胎工程（embryoengineering)。

廣義而言，胚胎工程包括所有的對配子和胚胎的操縱以及人為地干預的現代方法。MammalEmbryoBio-engineering4、動物胚胎工程主要技術體外受精、顯微受精與體外培養技術胚胎移植技術卵母細胞與胚胎冷凍保存技術嵌合體動物制備技術性別選擇與鑒定技術轉基因動物制備技術克隆技術二、動物胚胎移植技術供受體的情期同步，超數排卵與受精，受精卵的回收，胚胎質量的評價，移植，妊娠，動物（或人）出生寄母羊羔回收胚胎超排的母波爾羊雄波爾羊波爾山羊手術沖卵檢卵4細胞2細胞波爾山羊胚胎波爾山羊胚胎移入奶山羊輸卵管移植后縫合的創口40日齡B超診斷圖波爾羊羔與其養母（莎能奶山羊）動物的胚胎移植技術應用非常廣泛，……試管嬰兒人的胚胎移植？

第一代試管嬰兒（IVF）第二代試管嬰兒（ISCI)

第三代試管嬰兒（遺傳病診斷）北京時間10月4日下午5點30分，2010年諾貝爾生理學或醫學獎揭曉，英國科學家羅伯特·愛德華茲（RobertEdwards）因發展體外授精療法獲獎。羅伯特?愛德華茲1925年出生于英格蘭曼徹斯特。二戰中服完兵役后，他進入威爾士大學和愛丁堡大學學習生物學，1955年獲得博士學位，論文內容為小鼠胚胎發育。1958年他成為英國國立醫學研究所研究人員，開始了對人類授精過程的研究。從1963年開始，愛德華茲相繼在劍橋大學和BournHall診所（世界首個試管授精中心）工作。BournHall由愛德華茲和PatrickSteptoe所建立，愛德華茲擔任其研究主任多年。愛德華茲同時還是授精研究領域多本頂尖期刊的編輯。愛德華茲目前是劍橋大學名譽退休教授。早在1950年，愛德華茲就認為IVF可以有助不育癥的治療。通過系統的研究工作，他發現了人類受精的重要原理，并成功實現人類卵細胞在試管（或者更確切地說，是細胞培養皿）中受精。1978年7月25日，世界上第一例試管嬰兒的誕生，就是對愛德華茲的不懈努力的最好表彰。在接下來的幾年內，愛德華茲和他的同事將IVF進行改良，并將其與世界分享。到目前為止，因為IVF而得以出生的人大約有四百萬，他們中的許多人現已成年，甚至有的已為人父母了。在羅伯特?愛德華茲的引領下，對IVF療法的研究獲得了許多重要發現，一門新醫學領域也由此誕生。他的貢獻代表著現代醫學史上的一座里程碑三、克隆技術（一）克隆概念1、何為克隆？我們生活中還有:???仙人球木景花荷花菊花報羅蘭我們生活中還有:???

克隆是英文clone的音譯,簡單講就是一種無性繁殖。這門生物技術叫克隆技術.

克隆動物：遺傳物質完全一致的一組動物稱之為克隆動物。

細菌四細胞囊胚胎兒成體2、什么是有性繁殖？與無性繁殖的區別3、實現哺乳動物無性繁殖的途徑？第一種途徑：孤雌生殖第二種途徑：胚胎分割第三種途徑：細胞核移植第二節胚胎分割

胚胎分割是指把著床前胚胎經過切割一分為二、或一分為四、乃至一分為八，然后把這種半胚，1/4胚、和1/8胚移入受體生殖道后發育成個體。關鍵：一是分割后的胚胎能否發育成個體；二是分割后獲得的效率。

1、分割后的胚胎能否發育成個體動物種類胚胎分割數妊娠率（%）半胚移植一對半胚移植同卵雙胎妊娠（%）產仔（%）黃牛9246/96（47.9）54/181(29.8)46/175(26.3)8/35(22.9)奶牛18579/192(41.1)101/341(29.6)95/341(27.9)23/58(39.7)綿羊7736/77(46.8)48/14034.3)

10/28(35,7)綿羊5637/56(66.1)12/56(21.4)12/56(20.4)25/36(44.6)山羊10027/100(27.0)18/100(18)19/100(19.0)8/100(8.00)馬*22/4(50.0)2/4(50.0)2/4(50.0)

*每個受體僅移一個半胚

2、分割后獲得的效率(理論能夠提高一倍）方法胚胎數移植受體*妊娠(%)產仔數(%)平均每個胚胎產犢分割*666642/66(63.6)39/120(32.5)39/66(0.59)整胚移植757530/75(40.0)30/75(40.0)30/75(0.40)*分割：每個受體移二個半胚；整胚移植：每個受體移一個胚胎.表明,按每個胚胎的產犢數，胚胎分割的產犢效率較整胚移植可提高20%左右,其效率的提高主要表現在妊娠率的提高,顯然是和每頭受體移植胚胎數有關。其次是半胚移植后的同卵雙胎。乳牛胚胎分割和常規整胚胎移植效率比較

3、胚胎分割方法

（1)針切割

（2)刀切割

3、胚胎切割中存在的問題

（1）切割胚胎的發育期：顯然胚胎切割后的存活率是和胚胎具有的細胞數有關。（2）胚胎分割次數和分割胚的發育;從理論上講分割次數越多其可獲得的同卵多胎越多,事實上胚胎最終發育成個體必須有一個最低細胞數.分割次數動物種類分割胚胎數分割胚移植數妊娠(%)出生(%)平均每個胚胎獲后代

四分胚奶牛13396/20(30.3)6/39(15.48)6/13(0.461)牛20715/22(22.72)5/71(7.04)5/20(0.25)綿羊301067/24(29.16)10/106(9.43)10/30(0.33)八分胚綿羊11832/31(6.45)2/83(2.4)2/11(0.18)（3）胚胎質量：用于分割的胚胎其質量顯然影響效率胚胎等級分割胚胎數妊娠率(%)囊胚產犢率(%)優3522-35(62.9)24/66(36.4)良2312/23(52.9)9/40(22.5)可83/8(37.5)2/16(12.5)（4）分割胚胎在體外操作時間:在胚胎質量良好和合適的培養條件情況下,分割胚胎在體外的時間并不影響半胚的出生率；在體外時間(小時)妊娠率(%)囊胚出生率(%)1.5-3.015/25(60.0)8/38(21.1)3.1-5.06/11(54.5)6/22(27.2)5.1-8.016/30(53.5)16/60(27.6)5、胚胎切割的在家畜生產中的應用（1）分割胚可以發育成個體.半胚能提高生產率,四分胚和八分胚則因分割胚細胞數減少而降低,無實用價值。（2）胚胎分割可獲同卵雙胎(克隆動物)其效率在30%左右。首選是把一個卵對切后二個半胚同移于一個受體。（3）胚胎分割技術可用于胚胎的基因型鑒定。Nature,2004,428(22):860a、b,孤雌發育的小鼠；c,d妊娠19.5d的孤雌發育的小鼠（死亡）；e,孤雌發育的小鼠自然繁殖的后代第三節孤雌發育概念：是指雌性生殖細胞不經受精作用而直接成胚的一種生殖方式.作為一種特殊的遺傳生殖發育形式

第四節核移植動物一、核移植動物制備方法制備核移植動物主要有三種方法核移植動物制備方法－Ⅰ去、移核操作過程圖去核前去核中移核前移核中融合體內培養的NT羊胚胎克隆猴技術路線克隆人？核移植動物制備方法－Ⅱ克隆動物制備程序－ⅢABCDDay7blastocystwithoutzona

HandmadesomaticcellclonedbovineembryosdevelopinginWOWsatday2(a),day3(b),day4(c),day6(d)afterreconstruction.二、種間核移植何為種間核移植（克隆）？何為亞種間核移植（克隆）？為什么要做種間核移植？克隆類別供質供核種內核移植物種1物種1亞種間核移植物種1亞種1種間核移植物種1物種2三、核移植動物研究進展（一）異種體細胞核移植動物進展供質動物供核囊胚發育率（％）受體供核動物供核細胞類型受體動物數量妊娠數妊娠率出生克隆動物豬鼠8-cell卵裂球0/

兔大熊貓子宮上皮細胞9.9/

骨骼肌細胞6.8/

乳腺上皮細胞11.7/

家貓2129.520牛耳成纖維細胞11.1/

人顆粒細胞18.2/

成纖維細胞6.1/

軟骨細胞7.3、/

鼠8-cell卵裂球5.4/

奶牛綿羊成年皮膚成纖維細胞13.9綿羊14857.140豬成年皮膚成纖維細胞14.3豬25312.000猴成年皮膚成纖維細胞16.6/

大鼠成年皮膚成纖維細胞NA大鼠3226.250牦牛顆粒細胞10.9/

狗顆粒細胞0.4/

印度野公牛皮膚成纖維細胞12奶牛(cow)32825.000白臀野牛皮膚成纖維細胞NO奶牛(cow)301653.331羚牛

5/

牦牛

28/

綿羊盤羊顆粒細胞30.4

42501供核:印度野牛供質：家養奶牛卵母細胞受體：家養奶牛CLONING，Volume2,Number2,2000naturebiotechnology?VOLUME19?OCTOBER2001供核:毆洲盤羊供質：綿羊受體：綿羊SCIENCEVOL30018APRIL2003供核:白臀野牛供質：家養奶牛卵母細胞受體：家養奶牛（二）種內體細胞核移植動物進展－－核供核細胞類型分化程度存活克隆動物胚胎細胞分裂球小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛、猴桑椹、囊胚內細胞團細胞兔、山羊、綿羊、豬、牛胚胎干細胞兔、牛、小鼠胎兒細胞胚盤細胞（16天）綿羊胎兒成纖維細胞（32-40天）山羊、綿羊、牛胎兒肌肉細胞（60天）牛成體細胞乳腺上皮細胞（6歲）綿羊皮膚（2周）牛顆粒細胞小鼠、山羊，貓神經細胞、足細胞小鼠第一極體小鼠尾尖細胞小鼠輸卵管上皮細胞牛成年皮膚成纖維細胞牛，山羊，馬，狗胎兒成纖維細胞山羊，豬，綿羊，雪貂，騾Nature.1997Feb27;385(6619):810-3.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells

Reconstitutedembryos(left)aftercoculturewithBRLcellsinvitroor2days(X200).Rhesusmonkeyinfants(right)producedbynucleartransfertechnology.BiolReprod.1997Aug;57(2):454-9.Full-termdevelopmentofmicefromenucleatedoocytesinjectedwithcumuluscellnucleiNature.1998,394(6691):369-74.Clonedmice.a,Thefirstsurvivingclonedmouse,Cumulina(born3October1997)atfourweeks(foreground)withherfostermother.b,Cumulinaat2.5monthswiththepupssheproducedfollowingmatingwithaCD-1(albino)male.c,TwoB6C3F1-derived,cloned,agoutiyoung(centre)infrontoftheiralbinofostermother(CD-1),andaB6D2F1oocytedonor(black,right).Thetwoagoutioffspringinthecentreareclones(identical'twin'sisters)oftheagoutiB6C3F1cumulusdonorshownontheleft,andaretwooftheoffspringdescribedinseriesC(seetext)Tetra,anonhumanprimatequadrupletclonedfromaneight-cellembryobysplittingSci