雙抗體夾心一步半法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)【技術(shù)背景】目前檢測(cè)HBsAg的技術(shù)有：①兩位點(diǎn)一步法：可出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，待測(cè)抗原濃度過(guò)高出現(xiàn)假低值或假陰性；②兩步法：無(wú)鉤狀效應(yīng)；③一步半法：減少鉤狀效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)所采用的方法為一步半法，此法是基于抗原抗體特異性反應(yīng)的原理，因此對(duì)于所檢測(cè)的抗原其對(duì)應(yīng)的抗體是特異性的此法用于乙肝表面抗原是比較準(zhǔn)確的。【病人準(zhǔn)備】服用任何對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響的藥物。【標(biāo)本的采集與保存】血清：采用正確醫(yī)用技術(shù)采集靜脈血2ml，待血液自然完全凝固后，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取新鮮血清用于檢測(cè)。血漿：用抗凝血漿管（EDTA鹽、肝素之一作抗凝劑）采集靜脈血3000-3500轉(zhuǎn)10分鐘，取新鮮血漿用于檢測(cè)。血清樣品：5天內(nèi)測(cè)定，可以放置于4℃；超過(guò)一周，-80℃保存2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備用前三十分鐘從冰箱中取出的試劑盒和待測(cè)標(biāo)本，平衡至室溫18-2℃；將恒溫箱或恒溫水箱調(diào)至反應(yīng)溫度。【原理】將抗HBs的單克隆抗體（簡(jiǎn)稱單抗）或多克隆抗體（簡(jiǎn)稱多抗）板等固相載體上，加人待測(cè)血清和酶標(biāo)記抗體（抗HBs-HR，血清中HBsAg與微孔板上（抗HBs-HBsAg-HBs-HRP復(fù)合物中的HRP（A高低）HBsAgHBsAg的有無(wú)及相對(duì)含量。顯色為陽(yáng)性，不顯色為陰性。【試劑與器材】試劑 抗HBs包被的微孔板HBsAg陽(yáng)性對(duì)照HBsAg陰性對(duì)照酶標(biāo)試劑濃縮洗液、顯色劑A、顯色劑、終止劑、封板膜器材 加樣槍（20μ50μL-25μ、恒溫設(shè)備（恒溫水浴箱或恒溫箱、洗板機(jī)酶標(biāo)儀、吸水紙、消毒缸要求：a）酶標(biāo)儀在450nm和492nm的波長(zhǎng)不精密度應(yīng)在≤1%，分別在449nm-451nm491nm-493nm之間，吸光度值）要求可以測(cè)到小數(shù)點(diǎn)后兩位；b）100μl50μl%99-101μL49.5μL-50.5μL之間；c）恒溫系統(tǒng)在37℃、43℃的溫度變異應(yīng)成±1℃。【操作方法】編號(hào)將微孔板按序編號(hào)。每批實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照3孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照1孔，其余為待測(cè)血清孔孔。加樣品稀釋液：每孔加入樣品稀釋液20μL或一滴，空白孔不加。加樣：在待測(cè)血清孔、陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中加入相應(yīng)血清勻。37。50μL或1勻。37。將濃縮洗滌液用新鮮蒸餾水或去離子水稀釋20倍后備用。5次，每次都要在吸水紙上盡量拍干或用洗板機(jī)洗滌5次，最后一次盡量扣干。A和顯色劑B50μL1。比色測(cè)定：每孔加終止劑450nm，次波長(zhǎng)630nm，10min內(nèi)測(cè)定各孔吸光度（A）值【結(jié)果判定】1．臨界值Cutoff（CO）的計(jì)算：CO=陰性對(duì)照孔A均值×2.1（陰性對(duì)照孔A值低于0.05者，按0.05，高于0.05按實(shí)際A值計(jì)算計(jì)算）2.計(jì)算S/CO比值（S為樣品A值）陽(yáng)性結(jié)果：樣品A值≥CO值或S/CO1為HBsAg陽(yáng)性陰性結(jié)果：樣品ACO值或S/CO1為HBsAg陰性有效性判斷：陰性對(duì)照孔A值≤0.1，陽(yáng)性對(duì)照孔A值≥0.8。否則試驗(yàn)無(wú)效。【質(zhì)量控制】室內(nèi)質(zhì)量控制血清的兩個(gè)濃度值分別為：1ng/ml、2ng/ml，均購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，每批次試驗(yàn)加入兩個(gè)水平質(zhì)控血清各一孔，同其他待測(cè)樣本一同記錄S/CO值。一、分析前質(zhì)量控制1、標(biāo)本采集：規(guī)范操作意識(shí)；防止溶血；要正確使用抗凝劑和真空采血管；2、標(biāo)本處理：及時(shí)分離血清或血漿；高危標(biāo)本應(yīng)注明；標(biāo)本閉光、應(yīng)專人運(yùn)送。二、分析中質(zhì)量控制1、試劑、校準(zhǔn)品和耗材必須取得國(guó)家相關(guān)部門的批文，在有效期內(nèi)正確使用，妥善保藏，質(zhì)檢;2、選購(gòu)高質(zhì)量、有批文的儀器設(shè)備，要正確使用、定期檢查、維護(hù)和保養(yǎng)，使其在最佳狀態(tài)下運(yùn)轉(zhuǎn)；3、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)：一個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)同一項(xiàng)目用不同方法，試劑，儀器，或在不同地點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，需對(duì)不同方法，試劑，儀器，不同地點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)；4、嚴(yán)格規(guī)范操作程序：HBsAg測(cè)定項(xiàng)目和儀器應(yīng)有SOP，并嚴(yán)格遵守；參考區(qū)間等性能進(jìn)行核實(shí)、確認(rèn)和評(píng)價(jià)；6、對(duì)于脂血、溶血標(biāo)本應(yīng)采取一定措施，做室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控；7、室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)連續(xù)每天監(jiān)測(cè)，且試驗(yàn)時(shí)帶質(zhì)控物隨標(biāo)本一起測(cè)定，并對(duì)質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行分析判斷。三、檢驗(yàn)后質(zhì)量控制1、檢驗(yàn)結(jié)果的審核和發(fā)放：評(píng)價(jià)HBsAg的測(cè)定結(jié)果與檢驗(yàn)對(duì)象的符合性；根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性和可靠性；判斷標(biāo)本的檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，檢驗(yàn)報(bào)告是否可發(fā)出。量評(píng)價(jià)。【影響因素與注意事項(xiàng)】混合血清、血漿或其他體液樣本，特殊檢材的要求及結(jié)果判斷見(jiàn)其具體要求。37℃孵育1.5～2時(shí)，2000RPM5分鐘，分離血清。③采用含有分離膠和促凝劑的試管采集的血液樣本，采集后在37℃孵育0.5～1小時(shí)，2000RPM以上離心5分鐘，分離血清。④不使用任何熱處理過(guò)的標(biāo)本，嚴(yán)重溶血或脂血標(biāo)本不能使用。高濃度RF、高膽紅素、溶血、高脂等標(biāo)本可能干擾實(shí)驗(yàn)，應(yīng)避免使用。⑤.存放：樣本于2-8℃可儲(chǔ)存一周；樣本長(zhǎng)期儲(chǔ)存應(yīng)放置于-20℃或-20℃以下環(huán)境中，且不宜反復(fù)凍融。試劑切勿混用或互換。HBsAg定處理所使用組分及樣品。讀數(shù)為準(zhǔn)。洗板結(jié)束后，必須立即進(jìn)行下一步，不可使酶標(biāo)板孔干燥。封板膜不能重復(fù)使用顯色