微生物顯微鏡和顯微技術1/7/20232微生物顯微鏡和顯微技術借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術，顯微技術是微生物檢驗技術中最常用的技術之一。1/7/20233微生物顯微鏡和顯微技術顯微鏡的種類和原理顯微觀察樣品的制備1/7/20234微生物顯微鏡和顯微技術一、顯微鏡的種類和原理(一)、光學顯微鏡普通光學顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡現在的光學顯微鏡分辨的最小極限達0.2μm。1/7/20235微生物顯微鏡和顯微技術普通光學顯微鏡的幾個基本概念1/7/20236微生物顯微鏡和顯微技術1/7/20237微生物顯微鏡和顯微技術1/7/20238微生物顯微鏡和顯微技術1/7/20239微生物顯微鏡和顯微技術1/7/202310微生物顯微鏡和顯微技術1、普通光學顯微鏡由三部分構成①照明系統：包括光源和聚光器；②光學放大系統：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，目鏡和物鏡都由復雜的透鏡組構成；③機械裝置：用于固定材料和觀察方便1/7/202311微生物顯微鏡和顯微技術油鏡使用光鏡使用方法1/7/202312微生物顯微鏡和顯微技術2、暗視野顯微鏡原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。適用范圍：生活細菌運動性觀察。

1/7/202313微生物顯微鏡和顯微技術特點:只能看到物體的存在與運動,不能辨清其微細結構。暗視野顯微鏡的使用1/7/202314微生物顯微鏡和顯微技術基本原理:把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。3、相差顯微鏡相差顯微鏡使用1/7/202315微生物顯微鏡和顯微技術微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態適用范圍：對透明的活體進行直接觀察1/7/202316微生物顯微鏡和顯微技術4、熒光顯微鏡原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長較長的可見光，發熒光的物體會在黑暗背景顯現為光亮有色物體1/7/202317微生物顯微鏡和顯微技術綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌綠色：微管紅色：微絲藍色：核1/7/202318微生物顯微鏡和顯微技術1931年在德國柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的。用高速電子束代替光束。放大倍數可達80萬倍，分辨的最小極限達0.2納米。

（二）電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡1/7/202319微生物顯微鏡和顯微技術1、透射電子顯微鏡目前TEM的分辨力可達0.2nm。用電子束作光源，用電磁場作透鏡。用于電鏡的標本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。放大倍數最高可達近百萬倍.由電子照明系統、電磁透鏡成像系統、真空系統、記錄系統、電源系統等5部分構成。1/7/202320微生物顯微鏡和顯微技術高爾基體的TEM照片(偽彩色)1/7/202321微生物顯微鏡和顯微技術1/7/202322微生物顯微鏡和顯微技術2、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理：電子束掃描，激發樣品表面放出二次電子，電子產生多少與標本表面立體形貌有關。電子經探測器收集，經光電倍增管和放大器，產生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結構1/7/202323微生物顯微鏡和顯微技術掃描電子顯微鏡原理1/7/202324微生物顯微鏡和顯微技術1/7/202325微生物顯微鏡和顯微技術3、掃描隧道顯微鏡（STM）掃描隧道顯微鏡拍攝的7個鈾原子團1/7/202326微生物顯微鏡和顯微技術1/7/202327微生物顯微鏡和顯微技術4原子力顯微鏡1/7/202328微生物顯微鏡和顯微技術特點光學顯微鏡電子顯微鏡最高放大倍數約1000-150010萬以上最佳分辨率0.2微米0.5納米輻射源可見光電子束輻射源通過的媒介空氣高真空透鏡類型玻璃電磁體反差來源光吸收的差異或特定波長電子散射聚焦機械機械調節透鏡位置調節電磁透鏡的流向改變放大倍數的方法調換物鏡或目鏡調節電磁透鏡的流向樣品承載載玻片金屬網（通常為銅網）光學顯微鏡和電子顯微鏡的特點比較1/7/202330微生物顯微鏡和顯微技術（一）光學顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍染色簡單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、顯微觀察樣品的制備1/7/202331微生物顯微鏡和顯微技術（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。（2）懸滴法：蓋玻片中央加一小滴菌懸液，翻轉置于特制的凹載玻片上，觀察。（3）菌絲埋片法：無菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養，取下玻璃紙置于載玻片上，觀察菌絲形態。光學顯微鏡樣品制備－－活體觀察特點：避免染色對細胞結構的破壞，用于運動性、攝食特性、生長繁殖過程中形態變化等觀察

1/7/202332微生物顯微鏡和顯微技術用途：微生物的細致形態和結構染色前需要對樣品固定.常用固定方法：酒精火焰加熱、化學固定光學顯微樣品制備－－染色觀察1/7/202333微生物顯微鏡和顯微技術1)、簡單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢2）、革蘭氏染色法：涂片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復染→水洗→干燥→觀察1/7/202334微生物顯微鏡和顯微技術（二）、電子顯微鏡的制樣樣品在進行電鏡觀察前必須進行固定和干燥，制樣時一般采用重金屬鹽染色或噴鍍，提高在電鏡下的反差。1/7/202335微生物顯微鏡和顯微技術※1、透射電鏡的樣品制備負染技術投影技術超薄切片技術冰凍蝕刻技術1/7/202336微生物顯微鏡和顯微技術負染法將樣品的背景染色以凸現樣品，所以稱為負染法。一般是采用電子密度高，本身不會顯示任何結構，又和樣品不起反應的物質，如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時染色劑還會進入觀察對象的內部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反映樣品的內部結構。負染法原理1/7/202337微生物顯微鏡和顯微技術負染色法觀察的鞭毛用途：可以觀察細菌細胞、病毒等。1/7/202338微生物顯微鏡和顯微技術在真空條件下，用電子散射能力強的重金屬原子來噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒有噴鍍的區域形成了較強的反差，而沒有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據投影了解樣品的立體形狀、高度。投影法1/7/202339微生物顯微鏡和顯微技術投影法觀察的噬菌體用途：觀察細菌的鞭毛或病毒的顆粒1/7/202340微生物顯微鏡和顯微技術這是最常用的方法，可以觀察細胞或其它樣品內部的細微結構。樣品固定→脫水→包埋→切片。只有在20—100納米厚度的切片用透射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細菌樣品，一個細胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法觀察的一種厭氧弧菌1/7/202341微生物顯微鏡和顯微技術樣品-196℃迅速冷凍→加溫到-100℃→切割樣品→升華(真空)掉斷口處的冰→重金屬噴鍍斷口表面→電子顯微鏡觀察冰凍蝕刻法1/7/202342微生物顯微鏡和顯微技術冰凍蝕刻法制備的酵母菌內部結構圖優點:可以避免在固定、脫水和包埋過程中造成細胞結構的人為改變而形成的假象。1/7/202343微生物顯微鏡和顯微技術

2、、掃描電鏡樣品的制備樣品先要經過固定、脫水等處理，以免