第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程1第一節蛋白質工程概述一、蛋白質工程的概念蛋白質工程，就是根據對蛋白質已知結構和功能的了解，借助計算機輔助設計，利用基因定點誘變等技術，特異性地對現有蛋白質結構基因進行改造，借以改善蛋白質的物理和化學性質，如提高蛋白質的熱穩定性、酶的專一性等，或者利用化學和物理手段，對目標基因按預期設計進行修飾和改造，合成新的蛋白質的技術手段，并可以借此對蛋白質的結構與功能的關系進行更加深入的研究。第五章蛋白質工程

第一節蛋白質工程概述第五章蛋白質工程2二、蛋白質概述（一）蛋白質的組成組成蛋白質分子的化學元素主要有碳（50%～55%）、氫（6%～7%）、氧（19%～24%）和氮（13%～19%）。組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，其中除甘氨酸和脯氨酸外，均屬于L-α氨基酸，其結構通式如下（R為側鏈基團）（圖5-1）：第五章蛋白質工程

二、蛋白質概述第五章蛋白質工程3（二）蛋白質的結構蛋白質的一級結構蛋白質的二級結構蛋白質的三級結構蛋白質的四級結構第五章蛋白質工程

（二）蛋白質的結構第五章蛋白質工程4（三）蛋白質結構與功能的關系1.蛋白質一級結構與功能的關系(1)相似的結構具有相似的功能(2)不同結構具有不同的功能2.蛋白質空間結構與功能的關系空間結構發生改變，其功能活性也必然會隨之改變。第五章蛋白質工程

（三）蛋白質結構與功能的關系第五章蛋白質工程5第二節蛋白質工程的研究方法一、蛋白質工程的研究策略蛋白質工程的研究過程就是在對目標蛋白質的“結構功能”關系深入理解的基礎上，通過嚴格的分子設計，把它定向地改造成一個具有預期的新的特性的蛋白質。這類研究中一般有兩種情況：一種是對天然蛋白質進行改造；另一種是完全重建一個自然界原來沒有的新的蛋白質。第五章蛋白質工程

第二節蛋白質工程的研究方法第五章蛋白質工程6二、改變現有蛋白質的結構目前，蛋白質工程側重于改造現有的蛋白質這一領域，主要通過“小改”和“中改”技術來實現。（一）小改——少數幾個氨基酸殘基的替換小改是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個氨基酸殘基的替換。定點突變是目前蛋白質工程研究的主要技術手段。（二）中改——分子剪裁分子剪裁是指在對天然蛋白質的改造中替換一個肽段或一個結構域。第五章蛋白質工程

二、改變現有蛋白質的結構第五章蛋白質工程7三、蛋白質全新設計對蛋白質的全新設計所應用的技術手段是我們前面所提到的“大改”或“從頭設計”工作。從頭設計蛋白質是在人們認識蛋白質、掌握其結構規律并了解其結構功能關系的基礎上進行的。同時它也是人們更加深入、全面認識蛋白質的一個過程，它的目的是人工創造出自然界中不存在的蛋白質分子，使之具有人們所需要的特殊結構和功能，為人類所利用。目前該技術仍處于實驗初級階段。第五章蛋白質工程

三、蛋白質全新設計第五章蛋白質工程8第三節蛋白質工程的應用實例一、胰蛋白酶胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是絲氨酸蛋白酶類，它是一條單鏈肽，由223個氨基酸殘基組成，N末端為異亮氨酸。它主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。第五章蛋白質工程

第三節蛋白質工程的應用實例第五章蛋白質工程9胰蛋白酶極易自溶，自溶產物經層析分離后，會得到4個具有胰蛋白酶活性的片段。通過對N末端殘基的分析，表明這些活性產物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160處發生了斷裂而出現的。人們運用了蛋白質工程手段，對Arg117位自溶點進行了缺失突變，最終得到了穩定性明顯提高的突變株。第五章蛋白質工程

胰蛋白酶極易自溶，自溶產物經層析分離后，會得到4個具有胰蛋白10二、金屬硫蛋白金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物產生的金屬結合蛋白，是一類富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質，可以通過半胱氨酸的巰基結合大量的金屬元素，對多種重金屬有高度的親和性。一般由兩個大小相近、結構與功能類似的結構域組成，即α-結構域和β-結構域。人們為了在土壤中富集重金屬元素，并提高植物對重金屬的抗性，便將含有α-結構域的基因轉移到煙草中，成功地獲得了對鎘、銅、鉛等重金屬具有較高抗性的工程株。第五章蛋白質工程

二、金屬硫蛋白第五章蛋白質工程11三、人白細胞介素-2IL-2是第一個被發現的白細胞介素。天然人白細胞介素-2是一個由133個氨基酸殘基組成的多肽，133個氨基酸中共有3個半胱氨酸，其中有一個半胱氨酸（Cys125）以游離方式存在，而另兩個半胱氨酸（Cys58和Cys105）縮合成活性所必需的二硫鍵。第五章蛋白質工程

三、人白細胞介素-2第五章蛋白質工程12人們用蛋白質工程中的定位誘變技術將Cys125的密碼TGT轉換成TCT或GCA，使Cys125轉換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯誤配對的產生。結果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩定性等方面也得到了較明顯的改善。工程IL-2目前已被美國FDA批準上市，用于治療腎細胞瘤。我國衛生部也已經批準了在國內試生產基因工程白細胞介素-2。第五章蛋白質工程

人們用蛋白質工程中的定位誘變技術將Cys125的密碼TGT轉13四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子tPA能夠切割纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作為一種高效特異性溶血栓藥物。優點:(1)血栓選擇性高但幾乎不激活循環血液中的纖溶系統，可直接靜脈注射；(2)對中毒性休克引起的彌散性血管內凝血療效顯著等。第五章蛋白質工程

四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子第五章蛋白質工程14利用基因定點誘變技術，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減少或避免了糖基化，有效地減緩了它在血漿中被清除的速率，達到了延長其半壽期的目的，臨床應用價值得到有效提高。第五章蛋白質工程

利用基因定點誘變技術，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減15五、枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶根據來源的不同可分為Carlsberg、E、BL、YaB等多種。枯草桿菌蛋白酶可以催化蛋白質，把蛋白質水解成氨基酸。具有重要的應用價值，被廣泛應用在洗滌劑、制革及絲綢工業中，是一種重要的工業用酶。三維結構及編碼基因目前已經基本搞清楚，而且配有合適的克隆、表達系統以及準確的定量分析催化活性的方法，因此缺點目前已經可以通過蛋白質工程得到改進。第五章蛋白質工程

五、枯草桿菌蛋白酶第五章蛋白質工程16對枯草桿菌蛋白酶所做的定點誘變已有400多個，在理論和應用方面均取得了相當大的進展和成功。枯草桿菌蛋白酶早在幾十年前就被開發成為商用的紡織品洗滌劑的添加酶，目前仍然是最基本、最重要，也是使用最廣泛、最成熟的洗滌用酶。應用定點改造后的枯草桿菌蛋白酶制成的洗滌劑，便可以實現與漂白劑共同使用的目的了。另一方面枯草桿菌蛋白酶在作為蛋白質工程的研究對象過程中，不僅僅使它自身的諸多性能得到了改善；更為重要的是在研究它的過程中，蛋白質工程的研究理論同時也得到了大大的豐富，這為蛋白質工程技術應用于其他酶的研究，尤其是對其他工業酶的性能改造提供了非常珍貴的范例和理論指導。第五章蛋白質工程

對枯草桿菌蛋白酶所做的定點誘變已有400多個，在理論和應用方17實訓六胰蛋白酶酶活力的測定第五章蛋白質工程

實訓六胰蛋白酶酶活力的測定第五章蛋白質工程18第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程19第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程20第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程21第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程22第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程23第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程24第五章蛋白質工程

第五章蛋白質工程25第一節蛋白質工程概述一、蛋白質工程的概念蛋白質工程，就是根據對蛋白質已知結構和功能的了解，借助計算機輔助設計，利用基因定點誘變等技術，特異性地對現有蛋白質結構基因進行改造，借以改善蛋白質的物理和化學性質，如提高蛋白質的熱穩定性、酶的專一性等，或者利用化學和物理手段，對目標基因按預期設計進行修飾和改造，合成新的蛋白質的技術手段，并可以借此對蛋白質的結構與功能的關系進行更加深入的研究。第五章蛋白質工程

第一節蛋白質工程概述第五章蛋白質工程26二、蛋白質概述（一）蛋白質的組成組成蛋白質分子的化學元素主要有碳（50%～55%）、氫（6%～7%）、氧（19%～24%）和氮（13%～19%）。組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，其中除甘氨酸和脯氨酸外，均屬于L-α氨基酸，其結構通式如下（R為側鏈基團）（圖5-1）：第五章蛋白質工程

二、蛋白質概述第五章蛋白質工程27（二）蛋白質的結構蛋白質的一級結構蛋白質的二級結構蛋白質的三級結構蛋白質的四級結構第五章蛋白質工程

（二）蛋白質的結構第五章蛋白質工程28（三）蛋白質結構與功能的關系1.蛋白質一級結構與功能的關系(1)相似的結構具有相似的功能(2)不同結構具有不同的功能2.蛋白質空間結構與功能的關系空間結構發生改變，其功能活性也必然會隨之改變。第五章蛋白質工程

（三）蛋白質結構與功能的關系第五章蛋白質工程29第二節蛋白質工程的研究方法一、蛋白質工程的研究策略蛋白質工程的研究過程就是在對目標蛋白質的“結構功能”關系深入理解的基礎上，通過嚴格的分子設計，把它定向地改造成一個具有預期的新的特性的蛋白質。這類研究中一般有兩種情況：一種是對天然蛋白質進行改造；另一種是完全重建一個自然界原來沒有的新的蛋白質。第五章蛋白質工程

第二節蛋白質工程的研究方法第五章蛋白質工程30二、改變現有蛋白質的結構目前，蛋白質工程側重于改造現有的蛋白質這一領域，主要通過“小改”和“中改”技術來實現。（一）小改——少數幾個氨基酸殘基的替換小改是指對已知結構的蛋白質進行少數幾個氨基酸殘基的替換。定點突變是目前蛋白質工程研究的主要技術手段。（二）中改——分子剪裁分子剪裁是指在對天然蛋白質的改造中替換一個肽段或一個結構域。第五章蛋白質工程

二、改變現有蛋白質的結構第五章蛋白質工程31三、蛋白質全新設計對蛋白質的全新設計所應用的技術手段是我們前面所提到的“大改”或“從頭設計”工作。從頭設計蛋白質是在人們認識蛋白質、掌握其結構規律并了解其結構功能關系的基礎上進行的。同時它也是人們更加深入、全面認識蛋白質的一個過程，它的目的是人工創造出自然界中不存在的蛋白質分子，使之具有人們所需要的特殊結構和功能，為人類所利用。目前該技術仍處于實驗初級階段。第五章蛋白質工程

三、蛋白質全新設計第五章蛋白質工程32第三節蛋白質工程的應用實例一、胰蛋白酶胰蛋白酶（EC3.4.21.4）是絲氨酸蛋白酶類，它是一條單鏈肽，由223個氨基酸殘基組成，N末端為異亮氨酸。它主要作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。第五章蛋白質工程

第三節蛋白質工程的應用實例第五章蛋白質工程33胰蛋白酶極易自溶，自溶產物經層析分離后，會得到4個具有胰蛋白酶活性的片段。通過對N末端殘基的分析，表明這些活性產物是由于Arg117-Val118、Lys145-Ser146及Lys159-Ala160處發生了斷裂而出現的。人們運用了蛋白質工程手段，對Arg117位自溶點進行了缺失突變，最終得到了穩定性明顯提高的突變株。第五章蛋白質工程

胰蛋白酶極易自溶，自溶產物經層析分離后，會得到4個具有胰蛋白34二、金屬硫蛋白金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是由微生物和植物產生的金屬結合蛋白，是一類富含半胱氨酸的短肽，是半胱氨酸殘基和金屬含量極高的蛋白質，可以通過半胱氨酸的巰基結合大量的金屬元素，對多種重金屬有高度的親和性。一般由兩個大小相近、結構與功能類似的結構域組成，即α-結構域和β-結構域。人們為了在土壤中富集重金屬元素，并提高植物對重金屬的抗性，便將含有α-結構域的基因轉移到煙草中，成功地獲得了對鎘、銅、鉛等重金屬具有較高抗性的工程株。第五章蛋白質工程

二、金屬硫蛋白第五章蛋白質工程35三、人白細胞介素-2IL-2是第一個被發現的白細胞介素。天然人白細胞介素-2是一個由133個氨基酸殘基組成的多肽，133個氨基酸中共有3個半胱氨酸，其中有一個半胱氨酸（Cys125）以游離方式存在，而另兩個半胱氨酸（Cys58和Cys105）縮合成活性所必需的二硫鍵。第五章蛋白質工程

三、人白細胞介素-2第五章蛋白質工程36人們用蛋白質工程中的定位誘變技術將Cys125的密碼TGT轉換成TCT或GCA，使Cys125轉換成絲氨酸或丙氨酸，避免了錯誤配對的產生。結果不但使IL-2的生物活性不受影響，而且其熱穩定性等方面也得到了較明顯的改善。工程IL-2目前已被美國FDA批準上市，用于治療腎細胞瘤。我國衛生部也已經批準了在國內試生產基因工程白細胞介素-2。第五章蛋白質工程

人們用蛋白質工程中的定位誘變技術將Cys125的密碼TGT轉37四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子tPA能夠切割纖溶酶原形成纖溶酶，從而激活纖溶作用(fibrino1ysis)，使血栓溶解。作為一種高效特異性溶血栓藥物。優點:(1)血栓選擇性高但幾乎不激活循環血液中的纖溶系統，可直接靜脈注射；(2)對中毒性休克引起的彌散性血管內凝血療效顯著等。第五章蛋白質工程

四、組織纖維蛋白溶酶原激活因子第五章蛋白質工程38利用基因定點誘變技術，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減少或避免了糖基化，有效地減緩了它在血漿中被清除的速率，達到了延長其半壽期的目的，臨床應用價值得到有效提高。第五章蛋白質工程

利用基因定點誘變技術，改變tPA分子中的某些糖基化氨基酸而減39五、枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)是由枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)合成的一種絲氨酸蛋白酶。枯草桿菌蛋白酶根據來源的不同可分為Carlsberg、E、BL、YaB等多種。枯草桿菌蛋白酶可以催化蛋白質，把蛋白質水解成氨基酸。具有重要的應用價值，被廣泛應用在洗滌劑、制革及絲綢工業中，是一種重要的工業用酶。三