細胞培養的基本理論知識

第一節細胞培養基本概念

一、細胞培養(cellculture)基本概念：

細胞培養是指從動物體內取出細胞或者組織，模擬體內的生理環境，在無菌、適溫和豐富的營養條件下，使離體細胞或者組織生存、生長并維持結構和功能的一門技術。

體外培養細胞培養（InVitro）

組織培養

器官培養不分細胞培養(Cellculture)：細胞（包括單個細胞）在體外條件下的生長。組織培養（TissueCulture）其本意是指從體內取出組織，摹擬體內生理環境，在無菌、適當溫度和一定營養條件下，使之生存和生長并維持其結構和功能的方法。注：組織培養和細胞培養并無嚴格區別！

器官培養（QrganCulture）,指的是應用和組織培養相似的條件，培養的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。細胞培養技術在遺傳學、免疫學、腫瘤學、病毒學、分子生物學等領域已得到廣泛的應用。

優點：

1.活細胞：

能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態、結構、生命活動等

二、細胞培養的優點與缺點2.可控制：

選擇對象：均一性、重復性

哪一種：類型：上皮？間質？

性質：正常？腫瘤？

階段：

調節條件：物理、化學、生物等因素可控

研究方法：可采用各種研究技術、記錄方法3.應用廣：學科多，對象廣。

4.較經濟：

可提供大量、同時、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象

缺點：

雖然現在人工模擬體內環境的技術已經很高,但人工所模擬的條件與體內實際仍不完全相同。當細胞被置于體外培養后,生活在缺乏動態平衡的環境中久了，必然發生變化。１.與體內主要不同相對孤立、相對單一，缺乏體內的系統作用、失去神經體液的調節和細胞相互間的影響。2.主要表現

失去原有組織結構和細胞形態，分化減弱或不顯，細胞趨向單一化；3.提示

要正確認識體外培養細胞：是一種特定條件下生長的細胞群體。

第二節培養物的生長生物學

一、體外培養細胞的生長類型

按生長方式分為二型粘附型細胞:

附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態下即可生長的細胞。

絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞。

粘附型細胞：粘附:是大多數有機體細胞在體內生存和生長發育的基本存在方式。

細胞在體內、外的粘附方式存在差異：

體內：粘附是全方位，外形具有復雜的立體特征

體外：多數情況，細胞只有一個附著平面，外形一般與體內時明顯不同按照培養細胞的主要形態，可分為以下類型：(1)上皮型細胞

(2)成纖維型細胞

(3)游走型細胞

(4)多形型細胞

(1)上皮型細胞(2)成纖維型細胞(3)游走型細胞(4)多形型細胞

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上皮樣細胞型

名稱：僅形態上似體內，實際上不完全等于來源：來源于外胚層，內胚層細胞（個別例外）如：皮膚及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性腫瘤形態：類似體內的上皮細胞扁平，不規則多角形，中有圓形核

生長特點易相連成片相靠—緊密相連—成薄層—鋪路石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細胞群而單個活動

成纖維細胞樣細胞

名稱：凡在培養中形態與成纖維細胞類似的來源：由中胚層間充質組織起源的組織如：真正的成纖維細胞心肌，平滑肌，成骨細胞，形態：似體內成纖維細胞的形態

胞體梭形或不規則三角形胞質向外伸出2—3個長短不等的突起中有卵圓形核生長特點

排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片，細胞—細胞接觸易斷開而

單獨行動游離的單獨的成纖維樣細胞，常有幾個伸長的細胞突起

體外培養的大鼠主動脈平滑肌細胞游走型細胞

具有類似巨噬細胞樣的特征。經常處于較活躍的變形及游走狀態，因此外形不規則且不斷變化。當細胞密度增大相互連接成片時，游走受限，形狀上類似上皮型細胞或成纖維細胞型的細胞。表現這種形態的細胞主要是具有吞噬作用的單核巨噬細胞系統的細胞，如顆粒性白細胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、肝枯否細胞(Kupffercell)以及某些腫瘤細胞等。

多形型細胞

多形型細胞是一些形態上不規則的細胞，但它不像成纖維細胞型的細胞那樣，不規則形態由寬扁的胞質突起所致。其細胞一般分胞體和胞突兩部分。胞突為細長形，似絲狀偽足。胞體雖略呈多角形，但沒有成纖維細胞型那樣不規則。體外培養中呈現多形型的細胞最常見的類型是神經元和神經膠質細胞。注意：細胞形態并非固定不變，可隨培養條件、生長時期、細胞數量等而變化細胞形態只是對培養物判斷或識別的參考指標若要確定某一培養物的確切細胞類型，必須借助更為特異的鑒定方法，如進行組織化學或免疫細胞化學染色鑒定。懸浮生長型

概念培養時不貼附于底物而呈懸浮狀態生長來源來自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞，腫瘤細胞也可能特點在懸浮中生長良好，細胞圓形，單個或小細胞團優點生存空間大，提供數量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲

缺點觀察不方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)

小結：體外培養細胞的生長類型粘附型細胞懸浮型細胞：血細胞以及某些腫瘤細胞

上皮型細胞成纖維型細胞

游走型細胞

多形型細胞

原代培養：取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養。傳代培養：細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中繼續培養的過程。原代培養傳代培養選取生長良好的細胞加入胰蛋白酶消化液鏡下觀察倒去酶液，加入培養液反復吹打制成細胞懸液按比例分裝后培養第三節培養細胞的生存環境與條件１．細胞的營養需要：１）基本營養物質：

氨基酸（１２種＋谷氨酰胺）維生素葡萄糖、核糖、脫氧核糖等無機離子等２）促細胞生長因子：多由血清提供

２．細胞的生存環境１）溫度條件對細胞生長的影響不同生物來源的組織細胞培養溫度不同；體外培養動物細胞最常用的溫度是37℃。耐低溫不耐高溫！在生理溫度范圍內，溫度與細胞生長率之間存在正相關關系。２）氣相環境對細胞生長的影響動物細胞培養的氣相環境都是采用5%CO2與95%空氣（提供氧）的混合氣體。

O2參與細胞的能量代謝過程。

CO2用于維持培養液的酸堿度。

一般多為開放式培養

３）培養液的酸堿度對細胞生長的影響大多數的有機體細胞能在pH6.0～8.0的環境中生存。最適宜的pH值范圍是7.2～7.4。體外培養的正常細胞耐酸能力要強于耐堿能力４）無污染、無毒（前提條件！）

組織培養常用術語Cellculture(細胞培養)

：細胞（包括單個細胞）在體外條件下的生長，稱為細胞培養。在細胞培養中，細胞不再形成組織，但在實驗室口語中，人們常將它擴展至組織培養與器官培養。貼壁依賴性：為細胞需貼附于底物或支撐物上才能生長的性質。Primaryculture(原代培養)：從體內取出細胞或組織的第一次培養Passage(傳代或傳代培養)

將細胞從一個培養瓶轉移或移植到另一個培養瓶即稱為傳代或傳代培養。Suspensionculture（懸浮培養）細胞或細胞聚集體懸浮于液體培養基中增殖的一種培養方式。

Cellfusion（細胞融合）在體外培養條件下，經化學試劑、病毒或物理方法誘發，使兩個獨立的細胞融合成一個細胞。Confluent(匯合)：細胞相互連接成片占據所有底物面積。切勿與細胞融合相混淆。Sub-confluent（近匯合）：細胞在底物上生長接近，但尚未完全匯合。Cellline（細胞系）原代培養物經首次傳代成功后即成細胞系。如果不能繼續傳代或傳代數有限,可稱為有限細胞系，如可連續傳代，則可稱為連續細胞系。Clone(克隆)：單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體，它們的遺傳特性相同。Cellstrain(細胞株):從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。Cellgenerationtime(細胞一代時間)

單個細胞兩次連續分裂的時間間隔。populationdoublingtime（群體倍增時間）:在對數生長期進行計算的細胞增加一倍所需的時間。

第二章

組織培養設施和基本條件細胞培養設施和基本條件實驗室設計原則防止微生物污染和有害因素影響要求工作環境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵劃分不同功能區或用鋁合金板隔開無菌操作區應在室內較少走動的內側清洗和消毒安置在另室一般包括：準備室、培養室和緩沖室準備室：用于進行培養器皿的清洗、包裝、培養物質的準備和消毒以及供應物品的保藏等。培養室：用于進行細胞培養和各種無菌操作的實驗室。其基本條件是：清潔、無菌、干燥、不通風，并具有適宜的光線。天花板不宜高過2.5M。緩沖室：（更衣室）

實驗室設備

一、最常用的大型必備裝置和儀器

凈化工作臺、CO2培養箱、倒置顯微鏡、離心機、冰箱、電熱干燥箱、超純水裝置、消毒鍋、超聲波清洗器、恒溫水浴箱、冷凍保存裝置、天平等二、最常用的培養器具

l.過濾除菌裝置：不銹鋼正壓過濾器、一次性濾器

2.手術器械

3.培養器皿：溶液瓶、培養瓶、培養皿、多孔培養板、移液管和吸管、離心管

凈化工作臺（必備！）

外流式

（基本不用）側流式

直流式超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。注意檢查是否堵塞！（看酒精燈）

超凈工作臺結構和模式圖CO2培養箱：用于維持適當溫度、濕度與pH質量關鍵在控溫裝置，溫度變化一般不應超過0.5度;培養箱的溫度設在35～37℃，這是人和哺乳動物培養細胞的最適溫度。

培養容器需與外界保持通氣狀態箱內空氣應保持干凈，定期消毒（紫外燈、酒精）水槽:保持一定濕度二氧化碳培養箱電熱干燥箱烘干和干熱消毒玻璃器皿鼓風與升溫同時進行，100度時可停止鼓風禁止先升溫后鼓風100度以下時再打開箱門金屬器械、塑料制品、橡膠等不能在干燥箱內消毒電熱恒溫鼓風干燥箱高壓滅菌鍋學生正在進行細胞觀察倒置顯微鏡

倒置顯微鏡水純化裝置很少使用離子交換裝置處理的水蒸餾水裝置分金屬和玻璃兩種洗刷裝置人工洗刷超聲洗滌裝置玻璃吸管洗滌自動雙重純水蒸餾器

超純水儀正壓過濾器細胞冷凍貯存器離心機小型臺式離心機符合分離細胞要求加樣器離心機液氮罐Operationof

Micropipette

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