四固定化酶的性質固定化常常是一種化學修飾，酶本身的結構受影響。酶固定化后．其催化作用由均相移到異相，由此帶來的擴散限制效應、空間障礙、載體性質造成的分配效應等因素必然對酶的性質產生影響。四固定化酶的性質固定化常常是一種化學修飾，酶本身的結構受影空間障礙空間障礙擴散限制濃度梯度擴散限制濃度梯度分配效應分配定律描述溶質在兩個互不相溶的液相中的分配的定律。在一定溫度和壓力下，如果一種物質溶解在兩個同時存在的互不混溶的液體中，達到平衡后，該物質在兩相中的濃度比等于常數：分配效應分配定律(一)固定化后酶活力的變化多數情況下比天然酶小，其專一性也能發生改變。

例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對低分子底物苯酞精氨酸－對硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。(一)固定化后酶活力的變化多數情況下比天然酶小，其專一性也能酶活低的可能原因酶分子在固定化過程中，空間構象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會直接影響到活性中心對底物的定位作用內擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻包埋時酶被高分子物質半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶接近。酶活低的可能原因酶分子在固定化過程中，空間構象會有所變化，甚酶活反而高的原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾．或固定化過程提高了酶的穩定性。酶活反而高的原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾．或固定化過程(二)固定化對酶穩定性的影響穩定性實際應用大多數情況下酶經過固定化后其穩定性都有所增加。Merlose選擇50種固定化酶測試穩定性

(二)固定化對酶穩定性的影響穩定性實際應用穩定性提高方面:熱穩定性提高保存穩定性好對蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解對變性劑的耐受性提高,可耐受尿素、有機溶劑和鹽酸胍等蛋白質性劑的作用。對不同pH穩定性提高穩定性提高方面:熱穩定性提高A熱穩定性A熱穩定性B有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高提高固定化酶對各種有機溶劑的穩定性，使本來不能在有機溶劑中進行的酶反應成為可能。固定化酶在有機合成中應用會進一步發展。B有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高提高固定化酶對各種有機溶劑的CpH穩定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫16h測定酶活力固定化酶在pH5.5-10.3活力穩定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩定。固定化酶的pH穩定性明顯優于游離酶。CpH穩定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫固定化后酶穩定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點連接．可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。抑制酶的自降解。將酶與固態載體結合，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了降解。固定化后酶穩定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點連接．(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反應速度的綜合結果。固定化后，酶熱穩定性提高，最適溫度隨之提高。例如，湯亞杰等以交聯法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃。固定化后也可能降低固定化的最適溫度受固定化方法和固定化載體的影響。(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、pH穩定性增強(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、p最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環境

最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環境

[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件結果帶負電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。結果帶負電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較產物對最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴散障礙，使反應產物向外擴散受到一定限制。++++催化反應產物為酸性（H+），則最適pH比游離酶高（需OH-中和）反之則偏低，中性則不變。產物對最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴散障礙，使（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的底物，只對小分子量底物有效。

例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白質，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上后，對二肽或多肽作用保持不變，但對酪蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質取決于所用的酶及載體材料的性質。五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質取決于所用的[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件

酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態等發生變化;載體的影響.由于在固定化酶的周圍，形成了能對底物產生立體影響的擴散層以及靜電的相互作用等引起的變化。酶固定化后發生的性質變化.上述幾種影響因素綜合作用的結果。載體與酶的直接作用可能表現為活力喪失、破壞酶結構、封閉酶活性部位等。酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷六酶固定化載體材料研究新進展1磁性高分子微球

磁性高分子微球是指內部含有磁性金屬或金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳及其氧化物)的超細粉末,而具有磁響應性的高分子微球.六酶固定化載體材料研究新進展1磁性高分子微球

磁性高分子微球作為載體的優點(1)固定化酶從反應體系中分離和回收簡便。對于雙酶體系,當一種酶失活時,可以用磁性材料再固載另一種酶,回收后反復使用。(2)磁性載體固定化酶放入磁場穩定的流動床反應器中,可以減少反應體系中的操作,適合大規模連續化生產。(3)利用外部磁場可以控制磁性材料固定酶的運動方式和方向,替代傳統的機械攪拌,提高固定化酶的催化效率。作為載體的優點(1)固定化酶從反應體系中分離和回收簡便。對合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體存在下進行聚合反應,均可得到納米級的磁性微球合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體2其它新型載體導電聚合物作為酶固定化載體時可用于酶電極類生物傳感器的制備。光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶時,條件溫和,可獲得酶活力較高的固定化酶。N-異丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到溫敏性水凝膠載體,用于固定嗜熱菌蛋白酶時可實現均相催化和異相分離的統一2其它新型載體導電聚合物作為酶固定化載體時可用于酶電極類生4.3固定化細胞

固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等因素約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續使用的活力。這是在酶固定化基礎上發展起來的一項技術。4.3固定化細胞固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，固定化細胞比固定化酶優越點固定化細胞保持胞內酶系的原始狀態與天然環境，因而更穩定。固定化細胞保持了胞內原有的多酶系統，這對于多步催化轉換，如合成干擾素等，其優勢更加明顯，而且無需輔酶再生。還可固定化增殖細胞.固定化細胞比固定化酶優越點固定化細胞保持胞內酶系的原始狀態與固定化增殖細胞優點固定化細胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的多次培養、擴大，從而縮短了發酵生產周期，可提高生產能力；發酵穩定性好，可以較長時間反復使用或連續使用，有希望將發酵罐改變為反應柱進行連續生產；發酵液中含菌體較少，有利于產品分離純化，提高產品質量等。固定化增殖細胞優點固定化細胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度固定化細胞的缺點利用的僅是胞內酶，而細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副產物；細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用;載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性固定化細胞的缺點利用的僅是胞內酶，而細胞內多種酶的存在，會形一、固定化細胞分類分類方式固定化細胞細胞類型微生物細胞植物細胞動物細胞生理狀態死細胞完整細胞、細胞碎片、細胞器活細胞增殖細胞、靜止細胞、饑餓細胞一、固定化細胞分類分類方式固定化細胞細胞類型微生物細胞植物細固定化死細胞固定化死細胞一般在固定化之前或之后細胞經過物理或化學方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加細胞膜的滲透性或抑制副反應，所以比較適于單酶催化的反應。固定化死細胞固定化死細胞一般在固定化之前或之后細胞經過物理或固定化活細胞

固定化靜止細胞和饑俄細胞在固定化之后細胞是活的，但是由于采用控制措施，細胞并不生長繁殖，而是處于休眠狀態或饑餓狀態。固定化生長細胞又稱固定化增殖細胞．是將活細胞固定在載體上并使其在連續反應過程中保持旺盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。更適合于進行多酶順序連續反應。固定化活細胞固定化靜止細胞和饑俄細胞在固定化之后細胞是活的二、固定化細胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細胞的固定化。可采用微生物自身的絮凝能力來制備無載體固定化細胞。要求保持高的活力保留和具有操作穩定性。二、固定化細胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細胞的固幾種方法的特點

化學法(共價交聯)涉及菌或細胞的化學修飾。由于所用化學藥品的毒性，可引起細胞破壞。因此，反應耍在盡可能溫和的條件下進行。在使用中細胞間、細胞和載體間的鍵不易被底物或鹽所破壞，操作穩定性高。

吸附螯合法條件溫和、方法簡便，但載體和細胞間吸附力弱，操作時細胞易從載體脫落，特別是底物分子量高，介質的離子強度和pH變化情況下更是如此，所以操作穩定性差，但優點是可再生。包埋法從理論上來說細胞和載體間沒有束縛，固定化后應保持高活力，然而實際上限制酶活力的因素較多，且這類方法只適于小分子底物。要固定活細胞、增殖細胞，顯然包埋法占優勢，尤其采用卡拉膠、海藻酸鈣等材料更好。交聯法沒有良好機械強度．所以不適于實際應用。但可得到高細胞濃度，大多數情況難于再生。幾種方法的特點化學法(共價交聯)涉及菌或細胞的化學修飾。由三、固定化細胞的重要發展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶工程相結合，有可能使大規模培養過程中重組菌的穩定性問題得到較好解決。固定化工程菌和游離工程菌相比較，固定化細胞具有高細胞濃度、克隆產物高效表達、穩定性好等特性。三、固定化細胞的重要發展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶4.4固定化原生質體固定化細胞缺點:只能用于生產胞外產物由于載體的影響產物和底物的擴散受到影響.

溶解氧的傳遞和輸送受到影響.去除細胞壁障礙就可得到許多胞內產物,減少障礙.原生質體:去除細胞壁后的植物或其它生物細胞.原生質體缺點就是更脆弱,但用載體固定化后就具有高的穩定性,又比正常細胞少了胞壁障礙.4.4固定化原生質體固定化細胞缺點:4.5固定化酶和固定化細胞的表征一、評價固定化酶(細胞)的指標固定化酶(細胞)的活力偶聯率及相對活力的測定固定化酶(細胞)的半衰期4.5固定化酶和固定化細胞的表征一、評價固定化酶(細胞)的指1固定化酶(細胞)的活力固定化酶(細胞)的活力即是固定化酶(細胞)催化某一特定化學反應的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應的反應初速度來表示。固定化酶(細胞)的單位可定義為每毫克干重固定化酶(細胞)每分鐘轉化底物(或生產產物)的量，表示為μmol·min-1mg-1。如是酶膜、酶管、酶板．則以單位面積的反應初速度來表示．即μmol·min-1cm2。表示固定化酶的活力一般要注明下列測定條件：溫度、攪拌速度、固定化酶的于燥條件、固定化的原酶含量或蛋白質含量及用于固定化酶的原酶的比活力。1固定化酶(細胞)的活力固定化酶(細胞)的活力即是固定化酶(測定方法活力可在兩種基本系統——填充床或均勻懸浮在保溫介質中進行測定。①間歇測定

在攪拌或振蕩反應器中，在與溶液酶同樣測定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質中)進行，然后間隔一定時間取樣，過濾后按常規進行測定。如攪拌速度過快．會由于固定化酶破碎而造成活力上升。測定方法活力可在兩種基本系統——填充床或均勻懸浮在保溫介質中②連續測定固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。根據流速和反應速度之間關系，算出酶活力(酶的形狀可能影響反應速度)。在實際應用中，固定化菌不一定在底物飽和條件下反應，故測定條件要盡可能與實際工藝相同，這樣才能利于比較和評價整個工藝。②連續測定2偶聯率及相對活力的測定用于表征影響酶固有性質諸因素的綜合效應及固定化期間引起的酶失活.

固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶(或細胞)所顯示的活力占被固定的等當量游離酶(細胞)總活力的百分數。2偶聯率及相對活力的測定用于表征影響酶固有性質諸因素的綜合活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％偶聯率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)／加入蛋白活力x100％相對活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力-上清液中未偶聯酶活力)x100％活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％活力回收活力回收也可稱為有效系數、活力保留百分數、偶聯效率，它表示影響酶固有性質諸因素的綜合效應。靜態有效系數(η)是在起始速度條什下測得的活力回收。操作有效系數(η’)是在生產設備所要求的條件下測量的，是固定化酶制劑實用性的最有效數據之一。活力回收活力回收也可稱為有效系數、活力保留百分數、偶聯效率，η(或η’)＝1表示反應控制良好，固定化或擴散引起的酶活力損失不明顯(這種可能性不大)。

η(或η’)＜1表示固定時有損失，擴散限制有影響。

η(或η’)＞1可能發生在個別情況。原因可能是固定化活細胞的增殖或抑制因素的排除。η(或η’)＝1表示反應控制良好，固定化或擴散引起的酶活力3固定化酶(細胞)的半衰期固定化酶(細胞)的半衰期是指在連續測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間，以t1/2表示。固定化酶(細胞)的操作穩定性是影響實用的關鍵因素，半衰期是衡量穩定性的指標。在沒有擴散限制時，固定化酶(細胞)活力隨時間成指數關系，半衰期t1/2

＝0.693／KD

式中KD

＝-2.303／tXlg(E／E0)稱為衰減常數，其中E／E0是時間t后酶活力殘留的百分數。3固定化酶(細胞)的半衰期固定化酶(細胞)的半衰期是指在連續二、載體活化程度和固定化配基密度的測定用不同的方法活化不同的載體材料后，載體表面活化基團的密度可能有很大差別。因而能偶聯配基的量也不同。活化水平從每個聚苯乙烯微球偶聯幾個微摩爾的基團到每毫升交聯瓊脂糖偶聯幾百個微摩爾基團。配基分子密度太低，作用有限；相反，配基密度過高可能產生非持異結合作用或者造成靶分子的洗脫困難。二、載體活化程度和固定化配基密度的測定用不同的方法活化不同的4.6固定化酶及細胞的應用可用于生物大分子的固相合成和序列分析、親和分離、同相免疫分析、載體藥物及試劑、生物反應器及生物傳感器等領域。4.6固定化酶及細胞的應用可用于生物大分子的固相合成和序列主要的工業產品主要的工業產品固定化葡萄糖異構酶放線菌－－固定化酶60－65℃15min固定化葡萄糖異構酶放線菌－－固定化酶60－65℃15mi一、生物化學及分子生物學基礎研究固定化酶進行反應可操作性強，可用于酶的結構與功能的研究、多亞基酶及多酶體系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過程研究等。利用固定化酶相界面催化反應的特點，還可用它來復制酶膜的模型。將多酶系統包埋于微囊內，可用于酶系統的組裝、定位及代謝的研究等。一、生物化學及分子生物學基礎研究固定化酶進行反應可操作性強，一)酶的結構與功能研究酶亞基性質的研究醛縮酶有4個亞基，亞基不易分離，但可控制條件使酶分子只有一個亞基通過共價鍵與CNBr活化的瓊脂糖凝膠結合。當用濃度為8mol兒的尿素使蛋白變性后．未固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞基保留，這樣就可對單亞基進行研究.一)酶的結構與功能研究酶亞基性質的研究醛縮酶有4個亞基，亞基實驗結果說明該亞基具活力實驗結果說明該亞基具活力二、工業應用1拆分氨基酸氨基酸的光學拆分例如，將合成法制得的DL—型氨基酸的N—酰化衍生物，用氨基酸酰化酶進行不對稱水解，然后再利用生成的L—氨基酸與N—酰化—D氨基酸的溶解度之差分離出來。用這種方法可制得光學純度好、收率高的L—氨基酸．二、工業應用1拆分氨基酸固定化方法選擇固定化方法選擇將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、穩定性等比較高。具體做法：將DEAE交聯葡聚糖A-25(0H型)加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，37℃下攪拌5h，酶吸附在DEAE-Sephadex上，洗去未結合酶，即可得到固定化氨基酰化酶．將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、固定化氨基酰化酶柱非常穩定。在50℃條件下可連續使用30天，保持60％一70％活力。當酶柱活性下降時，可補加相應數量酶液進行簡單再生對提高酶的經濟效果非常有利。且DEAE交聯葡聚糖載體也非常穩定，使用期達5年，酶的吸附力、形狀、壓力損失等不發生變化。固定化氨基酰化酶柱非常穩定。在50℃條件下可連續使用30天，2.生物轉化葡萄糖果糖丹麥NovoZymes公司生產的固定化葡萄糖異構酶“Sweetzyme?

”有多種型號，它是由凝結芽抱桿菌的完整細胞經過凝聚、戊二醛交聯、干燥、過篩等步驟制得，其最適溫度為80℃，最適pH為8.0-8.2，在61℃使用時，其半衰期1650h。生產能力為2000一3000kg干糖漿／1kg固定化酶。2.生物轉化葡萄糖果糖最新一代SweetzymeIT產品是由篩選的鏈霉素菌種產生的。新的SweetzymeIT的主要優勢在于：在適宜的工業條件下，每公斤酶可產出約18,000kg的糖漿以干物料計，并增加活力及降低糖漿副產物的形成。最新一代SweetzymeIT產品是由篩選的鏈霉素菌種產生鏈霉菌屬葡萄糖異構酶SweetzymeIT的固定化過程基本上和凝結芽子包桿菌屬葡萄糖異構酶SweetzymeQ一樣。布氏增基離心細胞濃集物質，而細胞會因使用Manton-Ganlin均化器中的單一均化閥抽干濃集物而崩裂,壓力下降到300-350kg/cm細胞與戊二醛鍵結用陽離子絮凝劑稀釋和凝聚以給出清晰的水相過濾軸式擠壓機進行擠壓顆料在液相干燥器中干燥并過濾.在300-1000微米大小以用于固定化器操作中。鏈霉菌屬葡萄糖異構酶SweetzymeIT的固定化過程基本三、醫療方面的應用酶制劑已在臨床上取得有效應用，并逐漸發展用酶治病的酶療法。酶本身是一種蛋白質，進入人體后產生抗體，能引起患者過敏性休克。酶不穩定，易失活，進入人體后在蛋白酶作用下易被水解而失去治療作用。制成固定化酶，穩定性增加，不被蛋白酶水解，又不與機體直接接觸，可避免產生抗體，因而為酶治療開辟了前景。三、醫療方面的應用酶制劑已在臨床上取得有效應用，并逐漸發展用將酶包埋在半透膜性質的聚合物內，即可制得微小膠事囊型固定化酶。膠囊型酶使囊外蛋白酶、抗體等不能進入囊內部接觸，所以在利用其來治病時，不會在患者體內產生抗體，避免過敏性反應。將酶包埋在半透膜性質的聚合物內，即可制得微小膠事囊型固定化酶L天門冬酰氨酶是第一種用于治療癌癥的酶類藥物但天然的L—門冬酰胺酶進入人體會產生抗體，出現休克如制成固定化酶可避兔上述抗體反應。將尼龍薄膜制成微囊型固定化酶，或用硝酸纖細素微囊化再與戊二醛交聯用于治療小白鼠白血病，與對照組相比，療效明顯。L天門冬酰氨酶是第一種用于治療癌癥的酶類藥物四、診斷、分析方面的應用酶的專一性可以便酶在一個復雜體系中，不受其他物質千擾，準確地測出某一物質含量。目前國外已普遍將酶學分析法應用于化學分析和臨床診斷等方面。實踐證明酶學分析法具有靈敏度高、專一性強等優點。近來已發展成為快速、準確、靈敏、自動化的分析方法。四、診斷、分析方面的應用酶的專一性可以便酶在一個復雜體系中，1．酶試紙的應用將酶固定于紙片上，制成能測定某些物質的含量的試紙，用于診斷，非常簡便、迅速。尿糖試紙(葡萄糖氧化酶，過氧化氫酶）2．酶柱固定化酶裝入柱內，讓樣品通過酶柱后，用光化學或電化學方法測定流出液中底物的減少、產物的增加或輔助因子的變化1．酶試紙的應用2．酶柱3．酶管將酶直接共價結合于內徑1mm、長3m的尼龍管或聚苯乙烯管內壁，當待測溶液通過酶管后，生成的產物可以在自動分析系統中連續測定。目前已制成脲酶、葡萄糖氧化酶等酶管。國外已制成多種酶管自動分析儀，作為商品出售。其優點在于可連續、快速、自動地測定微量樣品。3．酶管4．酶電極酶電極可能是固定化酶當前研究和應用最活躍的領域之一，它使酶分析進展到高度簡便化、自動化、微型化和連續化。目前常用的幾種酶電極有：脲酶電極測定尿素、葡萄糖氧化酶電極測定葡萄糖、乳酸脫氫酶電極測定乳酸、青霉素酶電極測定青霉素等。4．酶電極五、環境保護方面的應用1．環境監則根據固定化酶用于化學分析的原理，固定化酶(細胞)也可以用于測定有毒物質含量以進行環境監測。2。處理工業廢水以往人們利用活性污泥來處理污水。現在人們嘗試從活性污泥中分離出微生物，然再后將其固定，由此組成快速、高效，能連續處理工業污水的系統。五、環境保護方面的應用1．環境監則四固定化酶的性質固定化常常是一種化學修飾，酶本身的結構受影響。酶固定化后．其催化作用由均相移到異相，由此帶來的擴散限制效應、空間障礙、載體性質造成的分配效應等因素必然對酶的性質產生影響。四固定化酶的性質固定化常常是一種化學修飾，酶本身的結構受影空間障礙空間障礙擴散限制濃度梯度擴散限制濃度梯度分配效應分配定律描述溶質在兩個互不相溶的液相中的分配的定律。在一定溫度和壓力下，如果一種物質溶解在兩個同時存在的互不混溶的液體中，達到平衡后，該物質在兩相中的濃度比等于常數：分配效應分配定律(一)固定化后酶活力的變化多數情況下比天然酶小，其專一性也能發生改變。

例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對低分子底物苯酞精氨酸－對硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般認為高分子底物受到空間位阻的影響比低分子底物大。(一)固定化后酶活力的變化多數情況下比天然酶小，其專一性也能酶活低的可能原因酶分子在固定化過程中，空間構象會有所變化，甚至影響了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會直接影響到活性中心對底物的定位作用內擴散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻包埋時酶被高分子物質半透膜包圍，大分子底物不能透過膜與酶接近。酶活低的可能原因酶分子在固定化過程中，空間構象會有所變化，甚酶活反而高的原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾．或固定化過程提高了酶的穩定性。酶活反而高的原因可能是偶聯過程中酶得到化學修飾．或固定化過程(二)固定化對酶穩定性的影響穩定性實際應用大多數情況下酶經過固定化后其穩定性都有所增加。Merlose選擇50種固定化酶測試穩定性

(二)固定化對酶穩定性的影響穩定性實際應用穩定性提高方面:熱穩定性提高保存穩定性好對蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解對變性劑的耐受性提高,可耐受尿素、有機溶劑和鹽酸胍等蛋白質性劑的作用。對不同pH穩定性提高穩定性提高方面:熱穩定性提高A熱穩定性A熱穩定性B有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高提高固定化酶對各種有機溶劑的穩定性，使本來不能在有機溶劑中進行的酶反應成為可能。固定化酶在有機合成中應用會進一步發展。B有機試劑及酶抑制劑的穩定性提高提高固定化酶對各種有機溶劑的CpH穩定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫16h測定酶活力固定化酶在pH5.5-10.3活力穩定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩定。固定化酶的pH穩定性明顯優于游離酶。CpH穩定性青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中．于37℃保溫固定化后酶穩定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點連接．可防止酶分子伸展變形。酶活力的緩慢釋放。抑制酶的自降解。將酶與固態載體結合，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了降解。固定化后酶穩定性提高的可能原因固定化后酶分子與載體多點連接．(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反應速度的綜合結果。固定化后，酶熱穩定性提高，最適溫度隨之提高。例如，湯亞杰等以交聯法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃。固定化后也可能降低固定化的最適溫度受固定化方法和固定化載體的影響。(三)固定化酶的最適溫度變化酶反應的最適溫度是酶熱穩定性與反(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、pH穩定性增強(四)固定化酶的最適pH變化1、固定化后最適pH升高了2、p最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環境

最適pH偏移的原因載體帶電荷影響酶所在微環境

[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件結果帶負電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較游離酶偏高。使用帶正電荷的載體其最適pH向酸性偏移。結果帶負電荷載體(陰離子聚合物)制備的固定化酶，其最適pH較產物對最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴散障礙，使反應產物向外擴散受到一定限制。++++催化反應產物為酸性（H+），則最適pH比游離酶高（需OH-中和）反之則偏低，中性則不變。產物對最適pH的影響

主要是由于固定化載體成為了擴散障礙，使（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的底物，只對小分子量底物有效。

例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白質，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上后，對二肽或多肽作用保持不變，但對酪蛋白的作用僅為游離酶的3%左右。（五）底物特異性由于存在空間位阻，可能不再作用于分子量較大的五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質取決于所用的酶及載體材料的性質。五影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物的性質取決于所用的[生物學]第4章四-固定化酶的性質課件

酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態等發生變化;載體的影響.由于在固定化酶的周圍，形成了能對底物產生立體影響的擴散層以及靜電的相互作用等引起的變化。酶固定化后發生的性質變化.上述幾種影響因素綜合作用的結果。載體與酶的直接作用可能表現為活力喪失、破壞酶結構、封閉酶活性部位等。酶本身的變化，主要由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷六酶固定化載體材料研究新進展1磁性高分子微球

磁性高分子微球是指內部含有磁性金屬或金屬氧化物(如鐵、鈷、鎳及其氧化物)的超細粉末,而具有磁響應性的高分子微球.六酶固定化載體材料研究新進展1磁性高分子微球

磁性高分子微球作為載體的優點(1)固定化酶從反應體系中分離和回收簡便。對于雙酶體系,當一種酶失活時,可以用磁性材料再固載另一種酶,回收后反復使用。(2)磁性載體固定化酶放入磁場穩定的流動床反應器中,可以減少反應體系中的操作,適合大規模連續化生產。(3)利用外部磁場可以控制磁性材料固定酶的運動方式和方向,替代傳統的機械攪拌,提高固定化酶的催化效率。作為載體的優點(1)固定化酶從反應體系中分離和回收簡便。對合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體存在下進行聚合反應,均可得到納米級的磁性微球合成方法合成方法是利用天然高分子材料包埋磁性微粒,或在磁流體2其它新型載體導電聚合物作為酶固定化載體時可用于酶電極類生物傳感器的制備。光敏性單體聚合物包埋固定化酶或帶光敏性基團的載體共價固定化酶時,條件溫和,可獲得酶活力較高的固定化酶。N-異丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得到溫敏性水凝膠載體,用于固定嗜熱菌蛋白酶時可實現均相催化和異相分離的統一2其它新型載體導電聚合物作為酶固定化載體時可用于酶電極類生4.3固定化細胞

固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學等因素約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續使用的活力。這是在酶固定化基礎上發展起來的一項技術。4.3固定化細胞固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，固定化細胞比固定化酶優越點固定化細胞保持胞內酶系的原始狀態與天然環境，因而更穩定。固定化細胞保持了胞內原有的多酶系統，這對于多步催化轉換，如合成干擾素等，其優勢更加明顯，而且無需輔酶再生。還可固定化增殖細胞.固定化細胞比固定化酶優越點固定化細胞保持胞內酶系的原始狀態與固定化增殖細胞優點固定化細胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的多次培養、擴大，從而縮短了發酵生產周期，可提高生產能力；發酵穩定性好，可以較長時間反復使用或連續使用，有希望將發酵罐改變為反應柱進行連續生產；發酵液中含菌體較少，有利于產品分離純化，提高產品質量等。固定化增殖細胞優點固定化細胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度固定化細胞的缺點利用的僅是胞內酶，而細胞內多種酶的存在，會形成不需要的副產物；細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用;載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性固定化細胞的缺點利用的僅是胞內酶，而細胞內多種酶的存在，會形一、固定化細胞分類分類方式固定化細胞細胞類型微生物細胞植物細胞動物細胞生理狀態死細胞完整細胞、細胞碎片、細胞器活細胞增殖細胞、靜止細胞、饑餓細胞一、固定化細胞分類分類方式固定化細胞細胞類型微生物細胞植物細固定化死細胞固定化死細胞一般在固定化之前或之后細胞經過物理或化學方法的處理，如加熱、勻漿、干燥、冷凍、酸及表面活性劑等處理，目的在于增加細胞膜的滲透性或抑制副反應，所以比較適于單酶催化的反應。固定化死細胞固定化死細胞一般在固定化之前或之后細胞經過物理或固定化活細胞

固定化靜止細胞和饑俄細胞在固定化之后細胞是活的，但是由于采用控制措施，細胞并不生長繁殖，而是處于休眠狀態或饑餓狀態。固定化生長細胞又稱固定化增殖細胞．是將活細胞固定在載體上并使其在連續反應過程中保持旺盛的生長、繁殖能力的一種固定化方法。更適合于進行多酶順序連續反應。固定化活細胞固定化靜止細胞和饑俄細胞在固定化之后細胞是活的二、固定化細胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細胞的固定化。可采用微生物自身的絮凝能力來制備無載體固定化細胞。要求保持高的活力保留和具有操作穩定性。二、固定化細胞的制備固定化酶的方法大部分適合于微生物細胞的固幾種方法的特點

化學法(共價交聯)涉及菌或細胞的化學修飾。由于所用化學藥品的毒性，可引起細胞破壞。因此，反應耍在盡可能溫和的條件下進行。在使用中細胞間、細胞和載體間的鍵不易被底物或鹽所破壞，操作穩定性高。

吸附螯合法條件溫和、方法簡便，但載體和細胞間吸附力弱，操作時細胞易從載體脫落，特別是底物分子量高，介質的離子強度和pH變化情況下更是如此，所以操作穩定性差，但優點是可再生。包埋法從理論上來說細胞和載體間沒有束縛，固定化后應保持高活力，然而實際上限制酶活力的因素較多，且這類方法只適于小分子底物。要固定活細胞、增殖細胞，顯然包埋法占優勢，尤其采用卡拉膠、海藻酸鈣等材料更好。交聯法沒有良好機械強度．所以不適于實際應用。但可得到高細胞濃度，大多數情況難于再生。幾種方法的特點化學法(共價交聯)涉及菌或細胞的化學修飾。由三、固定化細胞的重要發展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶工程相結合，有可能使大規模培養過程中重組菌的穩定性問題得到較好解決。固定化工程菌和游離工程菌相比較，固定化細胞具有高細胞濃度、克隆產物高效表達、穩定性好等特性。三、固定化細胞的重要發展方向-基因工程菌的固定將基因工程和酶4.4固定化原生質體固定化細胞缺點:只能用于生產胞外產物由于載體的影響產物和底物的擴散受到影響.

溶解氧的傳遞和輸送受到影響.去除細胞壁障礙就可得到許多胞內產物,減少障礙.原生質體:去除細胞壁后的植物或其它生物細胞.原生質體缺點就是更脆弱,但用載體固定化后就具有高的穩定性,又比正常細胞少了胞壁障礙.4.4固定化原生質體固定化細胞缺點:4.5固定化酶和固定化細胞的表征一、評價固定化酶(細胞)的指標固定化酶(細胞)的活力偶聯率及相對活力的測定固定化酶(細胞)的半衰期4.5固定化酶和固定化細胞的表征一、評價固定化酶(細胞)的指1固定化酶(細胞)的活力固定化酶(細胞)的活力即是固定化酶(細胞)催化某一特定化學反應的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應的反應初速度來表示。固定化酶(細胞)的單位可定義為每毫克干重固定化酶(細胞)每分鐘轉化底物(或生產產物)的量，表示為μmol·min-1mg-1。如是酶膜、酶管、酶板．則以單位面積的反應初速度來表示．即μmol·min-1cm2。表示固定化酶的活力一般要注明下列測定條件：溫度、攪拌速度、固定化酶的于燥條件、固定化的原酶含量或蛋白質含量及用于固定化酶的原酶的比活力。1固定化酶(細胞)的活力固定化酶(細胞)的活力即是固定化酶(測定方法活力可在兩種基本系統——填充床或均勻懸浮在保溫介質中進行測定。①間歇測定

在攪拌或振蕩反應器中，在與溶液酶同樣測定條件下(如均勻懸浮于保溫的介質中)進行，然后間隔一定時間取樣，過濾后按常規進行測定。如攪拌速度過快．會由于固定化酶破碎而造成活力上升。測定方法活力可在兩種基本系統——填充床或均勻懸浮在保溫介質中②連續測定固定化酶裝入具有恒溫水夾套的柱中，以不同流速流過底物，測定酶柱流出液。根據流速和反應速度之間關系，算出酶活力(酶的形狀可能影響反應速度)。在實際應用中，固定化菌不一定在底物飽和條件下反應，故測定條件要盡可能與實際工藝相同，這樣才能利于比較和評價整個工藝。②連續測定2偶聯率及相對活力的測定用于表征影響酶固有性質諸因素的綜合效應及固定化期間引起的酶失活.

固定化酶的活力回收是指固定化后固定化酶(或細胞)所顯示的活力占被固定的等當量游離酶(細胞)總活力的百分數。2偶聯率及相對活力的測定用于表征影響酶固有性質諸因素的綜合活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％偶聯率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力)／加入蛋白活力x100％相對活力＝固定化酶總活力／(加入酶的總活力-上清液中未偶聯酶活力)x100％活力回收＝固定化酶總活力／加入酶的總活力x100％活力回收活力回收也可稱為有效系數、活力保留百分數、偶聯效率，它表示影響酶固有性質諸因素的綜合效應。靜態有效系數(η)是在起始速度條什下測得的活力回收。操作有效系數(η’)是在生產設備所要求的條件下測量的，是固定化酶制劑實用性的最有效數據之一。活力回收活力回收也可稱為有效系數、活力保留百分數、偶聯效率，η(或η’)＝1表示反應控制良好，固定化或擴散引起的酶活力損失不明顯(這種可能性不大)。

η(或η’)＜1表示固定時有損失，擴散限制有影響。

η(或η’)＞1可能發生在個別情況。原因可能是固定化活細胞的增殖或抑制因素的排除。η(或η’)＝1表示反應控制良好，固定化或擴散引起的酶活力3固定化酶(細胞)的半衰期固定化酶(細胞)的半衰期是指在連續測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經歷的連續工作時間，以t1/2表示。固定化酶(細胞)的操作穩定性是影響實用的關鍵因素，半衰期是衡量穩定性的指標。在沒有擴散限制時，固定化酶(細胞)活力隨時間成指數關系，半衰期t1/2

＝0.693／KD

式中KD

＝-2.303／tXlg(E／E0)稱為衰減常數，其中E／E0是時間t后酶活力殘留的百分數。3固定化酶(細胞)的半衰期固定化酶(細胞)的半衰期是指在連續二、載體活化程度和固定化配基密度的測定用不同的方法活化不同的載體材料后，載體表面活化基團的密度可能有很大差別。因而能偶聯配基的量也不同。活化水平從每個聚苯乙烯微球偶聯幾個微摩爾的基團到每毫升交聯瓊脂糖偶聯幾百個微摩爾基團。配基分子密度太低，作用有限；相反，配基密度過高可能產生非持異結合作用或者造成靶分子的洗脫困難。二、載體活化程度和固定化配基密度的測定用不同的方法活化不同的4.6固定化酶及細胞的應用可用于生物大分子的固相合成和序列分析、親和分離、同相免疫分析、載體藥物及試劑、生物反應器及生物傳感器等領域。4.6固定化酶及細胞的應用可用于生物大分子的固相合成和序列主要的工業產品主要的工業產品固定化葡萄糖異構酶放線菌－－固定化酶60－65℃15min固定化葡萄糖異構酶放線菌－－固定化酶60－65℃15mi一、生物化學及分子生物學基礎研究固定化酶進行反應可操作性強，可用于酶的結構與功能的研究、多亞基酶及多酶體系組裝方式的研究及凝血及血栓溶解的生化過程研究等。利用固定化酶相界面催化反應的特點，還可用它來復制酶膜的模型。將多酶系統包埋于微囊內，可用于酶系統的組裝、定位及代謝的研究等。一、生物化學及分子生物學基礎研究固定化酶進行反應可操作性強，一)酶的結構與功能研究酶亞基性質的研究醛縮酶有4個亞基，亞基不易分離，但可控制條件使酶分子只有一個亞基通過共價鍵與CNBr活化的瓊脂糖凝膠結合。當用濃度為8mol兒的尿素使蛋白變性后．未固定的亞基被透析除去，只有固定化的亞基保留，這樣就可對單亞基進行研究.一)酶的結構與功能研究酶亞基性質的研究醛縮酶有4個亞基，亞基實驗結果說明該亞基具活力實驗結果說明該亞基具活力二、工業應用1拆分氨基酸氨基酸的光學拆分例如，將合成法制得的DL—型氨基酸的N—酰化衍生物，用氨基酸酰化酶進行不對稱水解，然后再利用生成的L—氨基酸與N—酰化—D氨基酸的溶解度之差分離出來。用這種方法可制得光學純度好、收率高的L—氨基酸．二、工業應用1拆分氨基酸固定化方法選擇固定化方法選擇將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、穩定性等比較高。具體做法：將DEAE交聯葡聚糖A-25(0H型)加至含有氨基酰化酶的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)中，37℃下攪拌5h，酶吸附在DEAE-Sephadex上，洗去未結合酶，即可得到固定化氨基酰化酶．將酶固定在DEAE—葡聚糖等陰離子交換柱載體上。其活力回收、固定化氨基酰化酶柱非常穩定。在50℃條件下可連續使用30天，保持60％一70％活力。當酶柱活性下降時，可補加相應數量酶液進行簡單再生對提高酶的經濟效果非常有利