3

原核生物的基因表達與操作3.1原核生物的基因表達3.2有功能的啟動子的分離3.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.4原核生物表達產物的分離純化3原核生物的基因表達與操作3.1原核生物的基因表達1原核生物的基因表達與操作課件2目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉化受體細胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA基因克隆的技術路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DN3大腸桿菌表達體系大腸桿菌表達體系4大腸桿菌表達體系優越性：1.對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達調控的分子機理有深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現有效、高水平的表達；4.大腸桿菌培養方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產。大腸桿菌表達體系優越性：1.對大腸桿菌的背景知識，特別是基5大腸桿菌中表達體系的不足：1.真核基因，在結構上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉錄信號同原核的不同。細菌的RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉錄終止信號功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子結構同細菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩定性。大腸桿菌中表達體系的不足：1.真核基因，在結構上同原核基因64.許多真核基因的蛋白質產物，都要經過轉譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數的這類修飾作用在細菌細胞中并不存在；5.細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質分子，并把它們降解掉。4.許多真核基因的蛋白質產物，都要經過7大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體8啟動子核糖體結合位點轉錄終止子啟動子核糖體結合位點轉錄終止子93.2有功能的啟動子的分離一般程序：1.選用一種適當的核酸內切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA2.接著將切割產生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質粒載體重組，按實驗設計要求使插入的片斷恰好緊鄰報告基因的上游位置3.隨后把此重組混合物轉化給大腸桿菌寄主細胞，構成質粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。3.2有功能的啟動子的分離一般程序：10報告基因（reportergene）：特指那些編碼產物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結構（重組質粒）是否已經導入寄主細胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據。報告基因（reportergene）：特指那些編碼產物可以11用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子用pK01篩選啟動子分離有功能啟動子的兩個實例：用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子分離有功能啟動子的兩個實12用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子1.構建質粒pBRH3B和pBRH12.篩選啟動子使用四環素（Tetr）作報告基因分離功能啟動子用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子1.構建質粒pBRH13用pK01篩選啟動子使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子能夠檢測啟動子活性強弱的新型質粒載體系統。來源于pBR322用pK01篩選啟動子使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因14檢測啟動子強弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉移一個磷酸集團給半乳糖分子，從而催化半乳糖發生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標記ATP，測定從ATP轉移到半乳糖去的32P的放射性強度，可推算報告基因（galK）表達的半乳糖激酶的產量。檢測啟動子強弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分15分離功能的啟動子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質粒載體的單克隆位點上；將DNA重組分子，轉化給宿主細胞（GalE＋、GalT＋、GalK－），避免內源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥氏培養基（含有PH值指示劑的中性紅和結晶紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉化子（重組子產生紅色的菌落）。分離功能的啟動子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質163.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.3.1可調控的啟動子3.3.2常用原核表達載體3.3.3提高蛋白的表達量3.3.6非融合蛋白的表達3.3.7融合蛋白的表達及純化3.3.9增強蛋白質的穩定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.11加強分泌內容：3.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.3.1可調控的啟17Lac(乳糖啟動子)Trp(色氨酸啟動子)Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)PL(λ噬菌體的左向啟動子)T7噬菌體啟動子3.3.1可調控的啟動子通過與阻遏蛋白的相互作用來控制基因的啟動和停止Lac(乳糖啟動子)3.3.1可調控的啟動子通過與阻遏蛋18大腸桿菌的Lac啟動子

來自大腸桿菌的乳糖操縱子由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個與乳糖利用有關的酶的結構基因所組成受活化蛋白和cAMP的正調控，阻遏蛋白的負調控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導LacUV5啟動子：Lac啟動子的衍生物大腸桿菌的Lac啟動子來自大腸桿菌的乳糖操縱子19大腸桿菌的trp啟動子

來自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結構基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結合，提高轉錄活性。

大腸桿菌的trp啟動子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子20Tac啟動子

是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子，其啟動能力比Lac和trp都強；受Lac阻遏蛋白的負調節，受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的誘導。Tac啟動子是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動21PL啟動子

λ噬菌體的左向啟動子PL來自λ噬菌體早期左向轉錄啟動子，活性比Trp啟動子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI

。在低溫(28-30℃)時，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動子轉錄。在高溫(42℃)時，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動子轉錄。PL啟動子λ噬菌體的左向啟動子PL來自λ噬菌體早期左向轉錄223.3.2常用原核表達載體含Lac啟動子的表達載體，如pOP203-13。含trp啟動子的表達載體，如pDR720。含tac啟動子的表達載體，如pKK223-3。含PL啟動子的表達載體，如pPL-λ。分泌蛋白表達載體3.3.2常用原核表達載體含Lac啟動子的表達載體，如p23融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產物可跨膜分泌至胞周間隙融合型表達載體：----融合蛋白243.3.3提高蛋白的表達量1、選擇合適載體，提高翻譯水平強啟動子----提高轉錄水平核糖體結合位點（ATG---SD）避免產物降解：分泌/融合表達細菌蛋白酶抑制劑3.3.3提高蛋白的表達量1、選擇合適載體，提高翻譯水平252、選擇合適宿主Lac啟動子----LacI菌PL啟動子--------cI857溶源菌

3、誘導表達溫度誘導------PLIPTG的化學誘導----Plac、Ptac4、提高表達蛋白的穩定性，防止被宿主降解2、選擇合適宿主26若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對外源基因進行定點突變或對宿主細菌進行改造。若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對外源基因進行定273.3.6非融合蛋白的表達非融合蛋白：指所表達的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。

3.3.6非融合蛋白的表達非融合蛋白：指所表達的外源蛋白28PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因非融合型蛋白表達PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因非融合29非融合蛋白特點：1、表達時要求高：SD序列與ATG的距離要合適。即使改變2-3個堿基，表達效率也會大受影響。2、優點：能夠較好地保持原來蛋白的活性。3、缺點：在宿主細胞內容易被蛋白酶降解，蛋白產量低；分離純化費時費力，成本較高。非融合蛋白特點：30非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷）營養缺陷型宿主菌2、利用細菌蛋白酶抑制劑非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷31融合蛋白：是指蛋白質的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質結合在一起，故稱為融合蛋白。

3.3.7融合蛋白的表達及純化融合蛋白：是指蛋白質的N末端由原核DNA3.3.7融合蛋32融合型蛋白表達PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因融合型蛋白表達PSDForeignDNA融合型表達載體融33融合蛋白的表達及純化1、構建融合蛋白表達載體：在外源蛋白的N或C端加標記物（如谷胱甘肽S-轉移酶標記物、6×組氨酸標記物、Flag或HA肽段標記物、CBP標記物等）；在標記物和外源蛋白之間插入一段可被蛋白酶識別的氨基酸序列。2、轉化原核細胞并誘導表達3、裂解細胞，親和柱層析分離融合蛋白4、切割融合蛋白獲得目的蛋白主要步驟：融合蛋白的表達及純化1、構建融合蛋白表達載體：在外源蛋白的N34例：谷胱甘肽S-轉移酶標記物例：谷胱甘肽S-轉移酶標記物35融合蛋白質的純化的基本原理：利用與融合蛋白質配偶體相對應的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質被滯留下來，其它蛋白質則流出柱外，經洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質。融合蛋白質的純化的基本原理：利用與融合蛋白質配偶36融合蛋白質中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。如胰島素的制備。2.胰蛋白酶切割法：能從精氨酸或是賴氨酸殘基羧基一側進行特異性的切割。3.凝血因子Xa切割法：能唯一地從特異識別序列C－末端切割多肽融合蛋白質中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：373.3.9增強蛋白質的穩定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.9增強蛋白質的穩定性383.3.11加強分泌外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位:1.細胞質中表達2.周質中表達3.胞外表達3.3.11加強分泌外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位391、細胞質中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，常會發生一種特殊的生理現象，形成包含體。包含體：存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。影響其形成的關鍵因素：電荷的平均數、形成轉角的氨基酸殘基組分1、細胞質中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，40優點：1.形成包含體a.蛋白質易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質受保護而免受胞內酶的降解作用c.蛋白質沒有活性，因此不會使寄主細胞受傷害優點：1.形成包含體412.蛋白質的產量高二硫鍵的斷裂以及轉譯修飾作用的喪失，會導致外源片斷編碼的蛋白質在大腸桿菌中超量表達。3.表達的質粒載體構建比較簡單。2.蛋白質的產量高42缺點：1.包含體a.蛋白質折疊了，再折疊的蛋白質可能無法恢復其生物學活性b.蛋白質的終產量偏低c.蛋白質的生產成本比較昂貴2.還原的環境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統、谷氧還蛋白系統）缺點：1.包含體433.蛋白質會被酶解4.蛋白質種類多，因此純化比較復雜原核生物的基因表達與操作課件442、周質中表達周質：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。在周質中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細胞質中穿過細胞質內膜進入周質。2、周質中表達周質：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌45優點：1.由于周質中蛋白質種類比較少，因此目標蛋白質的純化就比較簡單2.蛋白質酶解的程度不甚嚴重3.促進了二硫鍵的形成及蛋白質的折疊作用（氧化環境）在正確折疊的蛋白質，在轉運過程中，在體內對信號肽進行切割優點：46缺點：1.信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運2.有可能形成包含體缺點：473、胞外表達使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質，分泌到胞外培養基中進行分離純化。3、胞外表達使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質，分泌到胞48途徑：1.用大腸桿菌細胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質直接分泌到胞外培養基中。（不是特別有效的程序）2.誘導大腸桿菌細胞的外膜發生有限的滲漏，導致胞內的蛋白質向胞外培養基方向分泌。（可以分離到中等產量的蛋白質）途徑：49優點：1.蛋白質的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質種類少，因此目標蛋白容易純化3.增進了蛋白質的折疊作用

優點：50缺點：1.在大腸桿菌細胞中表達的外源真核蛋白質，通常是不會分泌到胞外培養基中去的2.由于分泌在胞外培養基中的蛋白質相當稀釋，因此目標蛋白質的純化過程比較復雜缺點：513.4原核生物表達產物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質的復性蛋白質的純化蛋白質的PEG化蛋白質的質量檢測3.4原核生物表達產物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質的521、包含體蛋白的提取細菌的收獲包含體的洗滌破碎離心包含體蛋白的變性（溶解）蛋白質的復性及純化（0.1%以下的中性去污劑，如Tween20）（變性劑：尿素、鹽酸胍提高PH、溫度及離子強度）（超聲破碎、機械破碎、化學方法破碎）（5000-10000g）1、包含體蛋白的提取細菌的收獲包含體的洗滌破碎離心包含體蛋白532、蛋白質的復性通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變性的完全伸展狀態恢復到正常的折疊結構，同時去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時復性過程開始，到2M左右時結束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，到1.5M

時復性過程已經結束。

復性中常采用的方法：稀釋復性、透析復性、超濾復性、柱上復性等。2、蛋白質的復性通過緩慢去除變性劑使目標蛋白從變543、蛋白質的純化層析類型離子交換層析親和層析疏水作用層析反相作用層析凝膠排阻層析經向層析分離技術3、蛋白質的純化層析類型離子交換層析親和層析疏水作用層析反相554、蛋白質的PEG化聚已二醇（polyethyleneglycol，PEG）是一種不帶電的線性親水分子，它可以與蛋白質的非必需基團共價結合，形成空間構象上的屏障，從而避免外源蛋白的抗原決定簇誘導產生抗體；甚至可以阻止抗體與之結合。在蛋白質的PEG化過程中，最關鍵的問題是確定最佳修飾程度和選用合適相對分子質量的PEG。4、蛋白質的PEG化聚已二醇（polyethyleneg563.4.5原核表達蛋白的質量控制3.4.5原核表達蛋白的質量控制57樹立質量法制觀念、提高全員質量意識。12月-2212月-22Wednesday,December21,2022人生得意須盡歡，莫使金樽空對月。12:31:0312:31:0312:3112/21/202212:31:03PM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦繃。12月-2212:31:0312:31Dec-2221-Dec-22加強交通建設管理，確保工程建設質量。12:31:0312:31:0312:31Wednesday,December21,2022安全在于心細，事故出在麻痹。12月-2212月-2212:31:0312:31:03December21,2022踏實肯干，努力奮斗。2022年12月21日12:31下午12月-2212月-22追求至善憑技術開拓市場，憑管理增創效益，憑服務樹立形象。21十二月202212:31:03下午12:31:0312月-22嚴格把控質量關，讓生產更加有保障。十二月2212:31下午12月-2212:31December21,2022作業標準記得牢，駕輕就熟除煩惱。2022/12/2112:31:0312:31:0321December2022好的事情馬上就會到來，一切都是最好的安排。12:31:03下午12:31下午12:31:0312月-22一馬當先，全員舉績，梅開二度，業績保底。12月-2212月-2212:3112:31:0312:31:03Dec-22牢記安全之責，善謀安全之策，力務安全之實。2022/12/2112:31:03Wednesday,December21,2022相信相信得力量。12月-222022/12/2112:31:0312月-22謝謝大家！樹立質量法制觀念、提高全員質量意識。12月-2212月-22583

原核生物的基因表達與操作3.1原核生物的基因表達3.2有功能的啟動子的分離3.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.4原核生物表達產物的分離純化3原核生物的基因表達與操作3.1原核生物的基因表達59原核生物的基因表達與操作課件60目的基因載體體外重組重組子（雜合DNA）轉化受體細胞篩選陽性克隆大量擴增，獲得子代DNA基因克隆的技術路線目的基因載體體外重組重組子（雜合DN61大腸桿菌表達體系大腸桿菌表達體系62大腸桿菌表達體系優越性：1.對大腸桿菌的背景知識，特別是基因表達調控的分子機理有深刻的了解；2.是一種安全的基因工程實驗體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體；3.許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細胞中實現有效、高水平的表達；4.大腸桿菌培養方便、操作簡單、成本低廉，易用于批量生產。大腸桿菌表達體系優越性：1.對大腸桿菌的背景知識，特別是基63大腸桿菌中表達體系的不足：1.真核基因，在結構上同原核基因之間存在著很大的差別。2.真核基因的轉錄信號同原核的不同。細菌的RNA聚合酶不能識別真核的啟動子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉錄終止信號功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子結構同細菌的有所差異，影響真核基因mRNA穩定性。大腸桿菌中表達體系的不足：1.真核基因，在結構上同原核基因644.許多真核基因的蛋白質產物，都要經過轉譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數的這類修飾作用在細菌細胞中并不存在；5.細菌的蛋白酶，能夠識別外來的真核基因所表達的蛋白質分子，并把它們降解掉。4.許多真核基因的蛋白質產物，都要經過65大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體66啟動子核糖體結合位點轉錄終止子啟動子核糖體結合位點轉錄終止子673.2有功能的啟動子的分離一般程序：1.選用一種適當的核酸內切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA2.接著將切割產生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質粒載體重組，按實驗設計要求使插入的片斷恰好緊鄰報告基因的上游位置3.隨后把此重組混合物轉化給大腸桿菌寄主細胞，構成質粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。3.2有功能的啟動子的分離一般程序：68報告基因（reportergene）：特指那些編碼產物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結構（重組質粒）是否已經導入寄主細胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據。報告基因（reportergene）：特指那些編碼產物可以69用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子用pK01篩選啟動子分離有功能啟動子的兩個實例：用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子分離有功能啟動子的兩個實70用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子1.構建質粒pBRH3B和pBRH12.篩選啟動子使用四環素（Tetr）作報告基因分離功能啟動子用大腸桿菌質粒pBR316篩選啟動子1.構建質粒pBRH71用pK01篩選啟動子使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子能夠檢測啟動子活性強弱的新型質粒載體系統。來源于pBR322用pK01篩選啟動子使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因72檢測啟動子強弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉移一個磷酸集團給半乳糖分子，從而催化半乳糖發生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標記ATP，測定從ATP轉移到半乳糖去的32P的放射性強度，可推算報告基因（galK）表達的半乳糖激酶的產量。檢測啟動子強弱的原理：半乳糖激酶能夠從ATP分73分離功能的啟動子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質粒載體的單克隆位點上；將DNA重組分子，轉化給宿主細胞（GalE＋、GalT＋、GalK－），避免內源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥氏培養基（含有PH值指示劑的中性紅和結晶紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉化子（重組子產生紅色的菌落）。分離功能的啟動子將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質743.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.3.1可調控的啟動子3.3.2常用原核表達載體3.3.3提高蛋白的表達量3.3.6非融合蛋白的表達3.3.7融合蛋白的表達及純化3.3.9增強蛋白質的穩定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.11加強分泌內容：3.3可調控強啟動子驅動的基因表達3.3.1可調控的啟75Lac(乳糖啟動子)Trp(色氨酸啟動子)Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)PL(λ噬菌體的左向啟動子)T7噬菌體啟動子3.3.1可調控的啟動子通過與阻遏蛋白的相互作用來控制基因的啟動和停止Lac(乳糖啟動子)3.3.1可調控的啟動子通過與阻遏蛋76大腸桿菌的Lac啟動子

來自大腸桿菌的乳糖操縱子由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動基因(P)、操縱基因(O)和編碼3個與乳糖利用有關的酶的結構基因所組成受活化蛋白和cAMP的正調控，阻遏蛋白的負調控受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半乳糖苷）、ONPG（鄰硝基苯基半乳糖苷）的誘導LacUV5啟動子：Lac啟動子的衍生物大腸桿菌的Lac啟動子來自大腸桿菌的乳糖操縱子77大腸桿菌的trp啟動子

來自大腸桿菌的色氨酸操縱子由啟動子、衰減子、操縱基因及trpE的部分結構基因組成受阻遏蛋白和衰減子的調控，阻遏蛋白前體必須與色氨酸結合才有活性3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結合，提高轉錄活性。

大腸桿菌的trp啟動子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子78Tac啟動子

是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子，其啟動能力比Lac和trp都強；受Lac阻遏蛋白的負調節，受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的誘導。Tac啟動子是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動79PL啟動子

λ噬菌體的左向啟動子PL來自λ噬菌體早期左向轉錄啟動子，活性比Trp啟動子高約11倍；受控于溫度敏感的阻遏蛋白cI

。在低溫(28-30℃)時，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL啟動子轉錄。在高溫(42℃)時，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使PL啟動子轉錄。PL啟動子λ噬菌體的左向啟動子PL來自λ噬菌體早期左向轉錄803.3.2常用原核表達載體含Lac啟動子的表達載體，如pOP203-13。含trp啟動子的表達載體，如pDR720。含tac啟動子的表達載體，如pKK223-3。含PL啟動子的表達載體，如pPL-λ。分泌蛋白表達載體3.3.2常用原核表達載體含Lac啟動子的表達載體，如p81融合型表達載體：----融合蛋白非融合型表達載體：---天然完整蛋白分泌型表達載體：----產物可跨膜分泌至胞周間隙融合型表達載體：----融合蛋白823.3.3提高蛋白的表達量1、選擇合適載體，提高翻譯水平強啟動子----提高轉錄水平核糖體結合位點（ATG---SD）避免產物降解：分泌/融合表達細菌蛋白酶抑制劑3.3.3提高蛋白的表達量1、選擇合適載體，提高翻譯水平832、選擇合適宿主Lac啟動子----LacI菌PL啟動子--------cI857溶源菌

3、誘導表達溫度誘導------PLIPTG的化學誘導----Plac、Ptac4、提高表達蛋白的穩定性，防止被宿主降解2、選擇合適宿主84若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對外源基因進行定點突變或對宿主細菌進行改造。若克隆的基因所用的密碼子為宿主罕見密碼子，可對外源基因進行定853.3.6非融合蛋白的表達非融合蛋白：指所表達的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。所表達的蛋白質以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細菌多肽序列。

3.3.6非融合蛋白的表達非融合蛋白：指所表達的外源蛋白86PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因非融合型蛋白表達PSDForeignDNA非融合型表達載體非融合基因非融合87非融合蛋白特點：1、表達時要求高：SD序列與ATG的距離要合適。即使改變2-3個堿基，表達效率也會大受影響。2、優點：能夠較好地保持原來蛋白的活性。3、缺點：在宿主細胞內容易被蛋白酶降解，蛋白產量低；分離純化費時費力，成本較高。非融合蛋白特點：88非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷）營養缺陷型宿主菌2、利用細菌蛋白酶抑制劑非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：1、選用Ion-（黃嘌呤核苷89融合蛋白：是指蛋白質的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質結合在一起，故稱為融合蛋白。

3.3.7融合蛋白的表達及純化融合蛋白：是指蛋白質的N末端由原核DNA3.3.7融合蛋90融合型蛋白表達PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因融合型蛋白表達PSDForeignDNA融合型表達載體融91融合蛋白的表達及純化1、構建融合蛋白表達載體：在外源蛋白的N或C端加標記物（如谷胱甘肽S-轉移酶標記物、6×組氨酸標記物、Flag或HA肽段標記物、CBP標記物等）；在標記物和外源蛋白之間插入一段可被蛋白酶識別的氨基酸序列。2、轉化原核細胞并誘導表達3、裂解細胞，親和柱層析分離融合蛋白4、切割融合蛋白獲得目的蛋白主要步驟：融合蛋白的表達及純化1、構建融合蛋白表達載體：在外源蛋白的N92例：谷胱甘肽S-轉移酶標記物例：谷胱甘肽S-轉移酶標記物93融合蛋白質的純化的基本原理：利用與融合蛋白質配偶體相對應的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質被滯留下來，其它蛋白質則流出柱外，經洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質。融合蛋白質的純化的基本原理：利用與融合蛋白質配偶94融合蛋白質中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。如胰島素的制備。2.胰蛋白酶切割法：能從精氨酸或是賴氨酸殘基羧基一側進行特異性的切割。3.凝血因子Xa切割法：能唯一地從特異識別序列C－末端切割多肽融合蛋白質中目的蛋白的純化1.溴化氰（CNBr）切割法：953.3.9增強蛋白質的穩定性3.3.10DNA整合入宿主染色體中3.3.9增強蛋白質的穩定性963.3.11加強分泌外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位:1.細胞質中表達2.周質中表達3.胞外表達3.3.11加強分泌外源蛋白質在大腸桿菌細胞中的表達部位971、細胞質中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，常會發生一種特殊的生理現象，形成包含體。包含體：存在于細胞質中的一種由不可溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。影響其形成的關鍵因素：電荷的平均數、形成轉角的氨基酸殘基組分1、細胞質中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細胞質中高效表達時，98優點：1.形成包含體a.蛋白質易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質受保護而免受胞內酶的降解作用c.蛋白質沒有活性，因此不會使寄主細胞受傷害優點：1.形成包含體992.蛋白質的產量高二硫鍵的斷裂以及轉譯修飾作用的喪失，會導致外源片斷編碼的蛋白質在大腸桿菌中超量表達。3.表達的質粒載體構建比較簡單。2.蛋白質的產量高100缺點：1.包含體a.蛋白質折疊了，再折疊的蛋白質可能無法恢復其生物學活性b.蛋白質的終產量偏低c.蛋白質的生產成本比較昂貴2.還原的環境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統、谷氧還蛋白系統）缺點：1.包含體1013.蛋白質會被酶解4.蛋白質種類多，因此純化比較復雜原核生物的基因表達與操作課件1022、周質中表達周質：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。在周質中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細胞質中穿過細胞質內膜進入周質。2、周質中表達周質：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌103優點：1.由于周質中蛋白質種類比較少，因此目標蛋白質的純化就比較簡單2.蛋白質酶解的程度不甚嚴重3.促進了二硫鍵的形成及蛋白質的折疊作用（氧化環境）在正確折疊的蛋白質，在轉運過程中，在體內對信號肽進行切割優點：104缺點：1.信號肽并非總是有助于蛋白質的轉運2.有可能形成包含體缺點：1053、胞外表達使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質，分泌到胞外培養基中進行分離純化。3、胞外表達使克隆在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白質，分泌到胞106途徑：1.用大腸桿菌細胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質直接分泌到胞外培養基中。（不是特別有效的程序）2.誘導大腸桿菌細胞的外膜發生有限的滲漏，導致胞內的蛋白質向胞外培養基方向分泌。（可以分離到中等產量的蛋白質）途徑：107優點：1.蛋白質的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質種類少，因此目標蛋白容易純化3.增進了蛋白質的折疊作用

優點：108缺點：1.在大腸桿菌細胞中表達的外源真核蛋白質，通常是不會分泌到胞外培養基中去的2.由于分泌在胞外培養基中的蛋白質相當稀釋，因此目標蛋白質的純化過程比較復雜缺點：1093.4原核生物表達產物的分離純化包含體蛋白的提取蛋白質的復性蛋白質的純化蛋白質的PEG化蛋白