關(guān)于原核生物基因表達(dá)的調(diào)控第一頁，共七十頁，2022年，8月28日6.1.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不斷完善。獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細(xì)菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細(xì)菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。文獻(xiàn)：細(xì)胞中存在兩種酶，即組成酶與誘導(dǎo)酶1947年，報告：“酶的適應(yīng)現(xiàn)象及其在細(xì)胞分化中的意義”FrancisJacob

JacquesMonod

6.1乳糖操縱元第二頁，共七十頁，2022年，8月28日1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成β-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細(xì)胞對誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。

Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第三頁，共七十頁，2022年，8月28日乙酰基轉(zhuǎn)移酶半乳糖苷透性酶?-半乳糖苷酶操作位點乳糖操縱元結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因第四頁，共七十頁，2022年，8月28日操縱元是一種完整的具有特定功能的細(xì)菌基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，操縱位點，結(jié)構(gòu)基因，組成一個控制單元結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)操縱位點promotor,operator：啟動子結(jié)合位點調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點結(jié)合）→結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物存在時，可與阻遏蛋白結(jié)合→結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄ControlelementStructuralgenes第五頁，共七十頁，2022年，8月28日6.1.2酶的誘導(dǎo)現(xiàn)象B-半乳糖苷酶第六頁，共七十頁，2022年，8月28日分解底物的酶只有在底物存在時才出現(xiàn)！無乳糖時，幾個B-gal/cell

加入乳糖時，5000個再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激發(fā)lacmRNA的合成

乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？培養(yǎng)基（35S-aa,無乳糖）→E.coli繁殖→培養(yǎng)基（無35S-aa,加入乳糖）→β-gal(無35S)第七頁，共七十頁，2022年，8月28日6.1.3調(diào)控機(jī)理1調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)lacI,1045bp，獨立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA第八頁，共七十頁，2022年，8月28日2.阻遏狀態(tài)第九頁，共七十頁，2022年，8月28日3誘導(dǎo)狀態(tài)誘導(dǎo)物誘導(dǎo)作用：在可誘導(dǎo)的操縱元中，加入對基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用的小分子后，開啟基因的轉(zhuǎn)錄活性第十頁，共七十頁，2022年，8月28日4誘導(dǎo)物不是乳糖生成lac誘導(dǎo)物乳糖代謝Allolctose異構(gòu)乳糖別乳糖細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶來源?第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日6.1.4阻遏蛋白的作用機(jī)制1阻遏蛋白結(jié)構(gòu)38KD，4聚體，一個亞基結(jié)合一個乳糖分子lacI

組成型轉(zhuǎn)錄

Pi弱啟動子，

5－10個／cell具有二重性阻止轉(zhuǎn)錄（與lacO結(jié)合）開始轉(zhuǎn)錄（與誘導(dǎo)物結(jié)合）第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日

阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)域

頭段，-NH2端，lacO結(jié)合區(qū)絞鏈區(qū)

核心段，-COOH，誘導(dǎo)物結(jié)合區(qū)第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日4個亞基的核心片段接觸形成四聚體第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日

對稱軸，+11對稱序列，6bp

阻遏蛋白的結(jié)合位點－－lacO的結(jié)構(gòu)第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日3阻遏蛋白對RNApol功能的影響阻遏蛋白和RNApol可同時與DNA結(jié)合

RNApol與啟動子結(jié)合的平衡常數(shù)1.9X107

有阻遏蛋白時,2.5X109結(jié)合著的RNApol不能轉(zhuǎn)錄.但加入誘導(dǎo)物后,釋放出阻遏蛋白,變?yōu)殚_放型啟動子復(fù)合物.阻遏蛋白實際上使RNApol貯存在啟動子上。這一模式是否存在于其它操縱元系統(tǒng)中？第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded6.1.5lacoperon的正調(diào)控

1代謝物阻遏效應(yīng)實驗，在lac＋Glu培養(yǎng)基上

E.coli只利用G，只有G

耗盡時，才會利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的轉(zhuǎn)錄：

可阻止誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng)僅去掉阻遏物并不能啟動lac基因表達(dá),有其它因素參與第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日葡萄糖對lac操縱元表達(dá)的抑制是間接的

乳糖的降解是通過cAMP與CAP結(jié)合起作用的

cAMP:環(huán)化腺苷酸CAP,cataboliteactivatorprotein

由crp編碼CRP,catabolitereceptorprotein第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日2CAP結(jié)合位點CAP為二聚體，45KD，被cAMP激活結(jié)合位點～22bpI-70~-50II-50~-40第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日由于序列的差異，使不同基因受cAMP激活的水平不同結(jié)合位點序列保守第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日3CAP的結(jié)合對DNA構(gòu)型的影響DNA彎曲彎曲點位于CAP結(jié)合位點二重對稱的中心彎曲使CAP能與啟動子上的RNApol接觸第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日（1）CAP結(jié)合位點與轉(zhuǎn)錄起始點的位置CAP與轉(zhuǎn)錄起始點的距離，相距數(shù)個整雙螺旋CAP結(jié)合位點在啟動子的上下游，都能發(fā)揮作用4

CAP對轉(zhuǎn)錄的影響第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日（2）基因轉(zhuǎn)錄對cAMP—CAP系統(tǒng)的依賴性，

與啟動子本身的效率有關(guān)cAMP-CAP復(fù)合物的結(jié)合，使位點II附近的富含GC區(qū)域雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，因而-10區(qū)的熔解溫度降低，促進(jìn)開放型啟動子復(fù)合物的形成第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日（3）CAP激活轉(zhuǎn)錄的方式CAP直接作用于RNApola亞基缺失RNApola亞基的—C末端時，失去受CAP激活的能力作用于DNA，改變其結(jié)構(gòu)第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日6.1.6lacoperon的其它問題1.lacoperon的功能是在正負(fù)兩個調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinateregulation)下實現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CAP不發(fā)揮作用；如沒有CAP加強轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從P上解聚仍無轉(zhuǎn)錄活性CAP組成型合成，所以cAMP－CAP復(fù)合物取決于cAMP含量腺苷酸環(huán)化酶位于細(xì)胞膜上，其活性與葡萄糖運輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMP－CAP調(diào)控乳糖、半乳糖、阿拉伯糖等糖類代謝有關(guān)的酶降解物敏感型操縱元：只要有葡萄糖存在，這些操縱元就不表達(dá)

第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日2.A基因及其生理功能編碼B-半乳糖苷乙酰基轉(zhuǎn)移酶，使半乳糖苷乙酰化。該酶不參與乳糖代謝！生理意義：在細(xì)胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質(zhì)，其分解產(chǎn)物不能進(jìn)一步代謝，積累，抑制細(xì)胞生長。半乳糖苷乙酰化后，即無毒.所以lacA雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質(zhì)的積累3.lac基因產(chǎn)物數(shù)量，1：0.5：0.2

不同酶的數(shù)量差異,是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié).方式有二:核糖體脫離:多順反子的差別性翻譯

內(nèi)切酶作用:在lacmRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日Summary第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日SummaryoflacoperonregulationGlucosecAMPLactoseTranscriptionoflacmRNAHighLowPresentlowrateofexpressionHighLowAbsentessentiallynoneLowHighAbsentessentiallynoneLowHighPresenthighrateofexpression第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日6.2Trpoperon生物細(xì)胞中的氨基酸合成，也受操縱元的調(diào)節(jié)。細(xì)胞需要某種氨基酸時，其基因即表達(dá)，不需要時基因關(guān)閉，達(dá)到經(jīng)濟(jì)的原則。第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162結(jié)構(gòu)基因t,A下游36bp,不依賴pt’,t下游250bp，依賴p6.2.1基因組成第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日sne298第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日6.2.2Trpoperon的阻遏系統(tǒng)1TrpR四聚體第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日阻遏蛋白＋trp

→有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不轉(zhuǎn)錄第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日2阻遏蛋白的結(jié)合位點

trpO-21~+1，反向重復(fù)序列trpP-40~+18活性阻遏物與trpO的結(jié)合與RNApol與啟動子的結(jié)合發(fā)生競爭SNE299第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日3阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動，在培養(yǎng)基中有少量Trp時，mRNA起始合成，但不能自動延伸，一般在trpE之前終止轉(zhuǎn)錄

粗調(diào)開關(guān)第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日6.2.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰減子，α前導(dǎo)RNA，140bpα第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日弱化子，衰減子，α第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日序列分析發(fā)現(xiàn)，其中4個片段進(jìn)行配對，形成不同的二級結(jié)構(gòu)Terminator第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日

S3122前導(dǎo)肽14aa第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日3轉(zhuǎn)錄弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNARibosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyond第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日HightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日弱化子對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵空間結(jié)構(gòu)，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)時間，核糖體停頓在2個Trp密碼子上時，產(chǎn)生延宕，此時4區(qū)未轉(zhuǎn)錄出來Theleaderpeptideistodeterminertrpavailabilityandtoregulatetranscriptiontermination14–amino-acid(encodedby27-68oftheleaderRNAsummary第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日6.2.4阻遏作用與弱化作用的協(xié)調(diào)

阻遏效率啟動子的轉(zhuǎn)錄起始頻率在R+和R-相差70倍弱化作用

trp存在時，約有10％的RNApol僥幸轉(zhuǎn)錄trp操縱子具有雙重調(diào)節(jié)體系？第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日Negative—repressibleoperon可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+為什么需要阻遏體系？當(dāng)大量Trp存在時，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。

經(jīng)濟(jì)第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日僅有少量trp時，RNApol啟動，但在L.S.處脫落，轉(zhuǎn)錄中斷RPOleadingseq.EDCBA少量trp+不足以結(jié)合

O

位點為什么需要弱化系統(tǒng)？當(dāng)trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一個能快速作出反應(yīng)的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適當(dāng)?shù)腡rp水平,弱化系統(tǒng)恰恰符合此要求。第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日6.2.5正控制系統(tǒng)和負(fù)控制系統(tǒng)1負(fù)控制系統(tǒng)：在沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因表達(dá)，加入調(diào)節(jié)蛋白后基因表達(dá)活性被關(guān)閉阻遏蛋白：負(fù)控制系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)蛋白第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日Addsignalmol.OperonoffCo-repressor輔阻遏物Addsignalmol.OperononInducer誘導(dǎo)物(inducibleoperon)(repressibleoperon)負(fù)控誘導(dǎo)負(fù)控阻遏第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日2正控制系統(tǒng)：沒有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)存在時基因關(guān)閉,加入這種調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)后基因活性被開啟誘導(dǎo)蛋白第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日6.3基因轉(zhuǎn)錄的時序調(diào)控概念：原核生物在生長發(fā)育的各個階段，基因的表達(dá)是按照一定時間順序進(jìn)行的意義有效利用能源避免不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，造成的危害途徑亞基的更換（枯草桿菌，E.coli，T4phage）

T7噬菌體生長過程中RNApol的替代噬菌體基因表達(dá)的調(diào)控第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日亞基的更換枯草桿菌噬菌體SPO1早中晚基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換SPO1，烈性噬菌體如何實現(xiàn)早中晚基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換?通過更換亞基，使SPO1的早中晚基因有條不紊地表達(dá)因子的負(fù)責(zé)識別啟動子的保守序列，是轉(zhuǎn)錄起始唯一需要的因子。許多細(xì)菌能生產(chǎn)多種可取代的因子，以識別不同的啟動子。當(dāng)細(xì)胞從基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達(dá)時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日早期，2‘55，產(chǎn)生gp28gp28

取代

55第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日中期，gp28取代55產(chǎn)生gp33,gp34第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日晚期,gp33,gp34取代

gp28，

55第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日枯草桿菌中每個因子都能識別具有特征性的一致序列的一組啟動子調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互取代的原因，可能是它們與核心酶的親和力所決定的第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日6.4小分子RNA的翻譯調(diào)節(jié)6.4.1干擾mRNA的互補RNAmRNA－interferingcomplementaryRNA1983年，Mizuno,Simon幾乎同時發(fā)現(xiàn)RNA可作為調(diào)節(jié)因子，與調(diào)節(jié)蛋白一樣，RNA合成后，可擴(kuò)散到靶位點。RNA也可作為調(diào)節(jié)物質(zhì)？！反義RNA，可與mRNA結(jié)合結(jié)合位點是S-D,AUG,部分N端密碼子與RNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，作為內(nèi)切酶底物與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄提前終止第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日例，Ecoli中外膜蛋白o(hù)mpF的表達(dá)調(diào)控λ噬菌體，cII蛋白抑制晚期基因轉(zhuǎn)錄Tn10中轉(zhuǎn)座酶翻譯的調(diào)節(jié)第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日6.4.2Ecoli中ompF

基因的翻譯調(diào)節(jié)Env，編碼滲透壓感受器的受體蛋白o(hù)mpC低滲時，ompC關(guān)閉，ompF增加高滲時，ompC增加，ompF下降ompC與ompF是外膜蛋白，受培養(yǎng)基滲透壓的調(diào)節(jié)第六十二頁，共七十頁，2022年，8月28日第六十三頁，共七十頁，2022年，8月28日RNAi技術(shù)1998年2月，AndrewFire等將單鏈RNA純化后注射線蟲時發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)