第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備

第四章第一節雜交瘤技術的基本原理第一節雜交瘤技術的基本原理第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)抗體種類第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibod。淋巴細胞。淋巴細胞。淋巴細胞發育。淋巴細胞發育。漿細胞。漿細胞。抗原接種。抗原接種BALB/c小鼠7~12周齡20~25g體重動物BALB/c小鼠動物B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體單克隆抗體B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體單克隆抗體聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養基的選擇培養：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體雜交瘤技術原理聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨流程流程RPM1640培養液DMEM培養液培養液RPM1640培養液培養液PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同細胞融合劑PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑細胞融合次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶胸腺嘧啶核苷激酶HGPRT酶與TK酶次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶HGPRT酶與TK酶H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNAHAT培養基H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤HAT培養基8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇應用液8-雜氮鳥嘌呤應用液不產生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細胞的動物品系相同骨髓瘤細胞系的選擇不產生Ig的重鏈和輕鏈骨髓瘤細胞系的選擇SP2/O:HGPRT-，TK-;長命淋巴細胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、淋巴細胞與雜交瘤細胞SP2/O:HGPRT-，TK-;長命骨髓瘤細胞、淋淋巴細胞：不能生長，5-7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5-7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻HAT選擇作用淋巴細胞：不能生長，5-7天死亡；DNA合成的主要途徑被A長期生長繁殖。利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA，從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力

雜交瘤細胞長期生長繁殖。

雜交瘤細胞有限稀釋法顯微操作法FACS法半固體瓊脂糖法克隆化有限稀釋法克隆化特點：不需任何特殊設備克隆出現效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養孔含0.5～1個細胞有限稀釋法特點：有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS效率最高FACS配制方案：雜交瘤細胞（1～5x106/ml)+細胞凍存液(30%-40%牛血清，50%-60%RPMI-1640培養液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃-40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇配制方案：雜交瘤細胞（1～5x106/ml)+細胞凍存液防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義防止污染細胞冷凍的意義第二節單克隆抗體制備第二節單克隆抗體制備選擇對數生長期的細胞進行傳代培養細胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞注意事項：切忌過多傳代培養，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中培養骨髓瘤細胞選擇對數生長期的細胞進行傳代培養培養骨髓瘤細胞1×108

淋巴細胞無菌手術免疫脾細胞的制備1×108淋巴細胞免疫脾細胞的制備細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養細胞其中MQ還有清除死亡細胞的作用飼養存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化采取飼養細胞細胞密度過低不利于細胞生長繁殖采取飼養細胞。飼養細胞。飼養細胞骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)50%PEG1min內加完;2min內加10ml培養液融合方法骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)融合方法SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2-51ml50%的PEG（無菌，預溫37℃）在1分鐘內滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養液一滴一滴加入,停止PEG作用根據細胞數量加入HAT培養基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數為0.5-1.5×105個。融合后7天，換用HT培養液。細胞融合SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2-5細胞融合10~20天出現克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養10~20天出現克隆融合細胞的早期培養可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細胞、亞細胞結構上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細胞）篩選常用方法可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法篩選常用方法ELISAELISAELISAELISA多頭加樣槍多頭加樣槍。免疫熒光法。免疫熒光法體外培養中空纖維培養系統

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除動物接種每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10╳105/只

生產單克隆抗體體外培養生產單克隆抗體

細胞性抗原：1-2×107/只，不加佐劑，2-3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3-6周100-200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠細胞性抗原：1-2×107/只，不加佐劑，2-3周重復腹腔注射法腹腔注射法前5天進行,預先腹腔注射pristane1~5×106細胞1~3w形成腹水高滴度腹水前5天進行,預先腹腔注射pristane高滴度腹水鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化鹽析沉淀McAb的純化Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblotMcAb的鑒定Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法McAb的鑒定

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低穩定低高沉淀反應無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbMcAbandPcAbMcAbandPcAb第三節基因工程抗體第三節基因工程抗體

根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。基因工程抗體

Geneticengineeringantibody根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區框架中，產生的抗體稱為CDR移植抗體將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人Ab，再經雜交瘤技術，產生大量完全人源化抗體人源化抗體將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區框架中，產生的抗體稱為C方法：從雜交瘤細胞分離出功能性可變區基因，與人Ig恒定區基因連接，插入適當表達載體，轉染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結合抗原的能力嵌合抗體chimericantibody方法：嵌合抗體chimericantibody嵌合抗體人抗體V區的骨架區取代鼠源單抗CDR以外骨架區改型抗體reshapedantibody人抗體V區的骨架區改型抗體定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療改形抗體（RAb）定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（

Fab：抗原結合片斷

Fv：可變區片段

ScFv：單鏈可變區片段小分子抗體Fab：抗原結合片斷小分子抗體小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合抗體融合蛋白其它生物活性蛋白融合抗體融合蛋白

許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。雙特異性抗體許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上的兩個化學交聯BsAb分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。基因工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab,Fv或ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。雙特異性抗體化學交聯BsAb雙特異性抗體細胞工程BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應(HAMA)，因此不適用于臨床。雙特異性抗體細胞工程BsAb雙特異性抗體定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優越性噬菌體抗體庫技術定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人

基本原理

用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫①從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉錄為cDNA；②應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的Ig基因片段；③構建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構建表面表達的噬菌體抗體庫(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；④表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。

構建噬菌體抗體庫①從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機重組也增加了抗體的多樣性噬菌體抗體庫特點模擬天然全套抗體庫噬菌體抗體庫特點避開了人工免疫和雜交瘤技術抗體庫的大容量抗體庫極高的篩選效率可獲得高親和力的人源化抗體VH和VL基因的隨機重組模擬了體內抗體親和力成熟的過程所用的抗體基因又來自人體避開了人工免疫和雜交瘤技術

第四節單克隆抗體應用第四節單克隆抗體應用診斷病原體腫瘤的診斷淋巴細胞表面標志物檢測檢驗醫學體外診斷試劑標記免疫測定診斷病原體檢驗醫學體外診斷試劑標記免疫測定肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEVTORCH：弓形蟲,風疹病毒,巨細胞病毒，單純皰疹病毒病原體測定肝炎病毒:HAV,HBV,HCV,HDV,HEV病原體測定CD4/CD8:Th/Tc白血病的分型細胞表面CD測定CD4/CD8:Th/Tc細胞表面CD測定內分泌疾病的診斷激素的測定藥物測定(TDM)抗排斥藥物抗腫瘤藥物地高辛內分泌疾病的診斷激素的測定藥物測定(TDM)抗排斥藥物越來越多未知功能cDNA的克隆對復雜的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加研究工作中的探針越來越多未知功能cDNA的克隆研究工作中的探針免疫沉淀免疫沉淀干擾素的精制物質的純化干擾素的精制物質的純化MACSMACS同位素標記McAb進行影像診斷體內定位診斷同位素標記McAb進行影像診斷體內定位診斷定義：

分子量較小但具有抗原結合功能的分子片段優點：分子量小,穿透性強,抗原性低不含Fc段，不會與帶有Fc段受體的細胞結合，不良反應少可在原核系統表達及易于基因工程操作半衰期短，有利于及時中和及清除毒素小分子抗體定義：小分子抗體用于腫瘤的導向治療腫瘤的影像分布基因治療細胞內抗體：在細胞內表達特異性識別某一基因產物可干擾該基因產物的生物活性研究基因結構與功能的關系用于腫瘤的導向治療腫瘤的體內顯像診斷單鏈抗體排除速度快，穿透力強，在腫瘤組織中的分布指數較完整抗體分子高放射顯像時，放射性核素排除較快，對身體危害程度小，顯像的本底較低理想的顯像定位診斷載體病毒的診斷和抗病毒感染血液性疾病的診斷白血病的免疫診斷及分型抗體融合蛋白腫瘤的體內顯像診斷抗體融合蛋白抗體分子可與放射性核素、細胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，這些分子在抗體結合靶分子后可提供重要輔助功能雙功能抗體可有效針對低水平的腫瘤相關抗原，并將細胞毒物質輸送到腫瘤細胞抗體還可與攜帶藥物的脂質體、各種PEG偶聯，從而增強體內運輸和藥代動力學體內免疫治療應用抗體分子可與放射性核素、細胞毒藥物、毒素、等多種分子相融合，

自身紅細胞凝集試驗快速檢測HBV和HIV病原體等避免化學交聯減低兩者的活性，從而提高酶免疫檢測的敏感度用雙特異抗體作為二抗，檢測限達1ng／ml雙特異抗體應用體外診斷自身紅細胞凝集試驗雙特異抗體應用體外診斷方法：雙特異抗體的一只臂結合靶抗原，一只臂結合半抗原螯合劑，后者可選擇性地與放射性核素結合，利用二次導向系統顯示特點：

更高的的靈敏度和清晰度體內腫瘤放射免疫顯像方法：體內腫瘤放射免疫顯像

第四章單克隆抗體與基因工程抗體的制備

第四章第一節雜交瘤技術的基本原理第一節雜交瘤技術的基本原理第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibody)第二代抗體單克隆抗體（monoclonalantibody)第三代抗體基因工程抗體（geneticengineeringantibody)抗體種類第一代抗體多克隆抗體（polyclonalantibod。淋巴細胞。淋巴細胞。淋巴細胞發育。淋巴細胞發育。漿細胞。漿細胞。抗原接種。抗原接種BALB/c小鼠7~12周齡20~25g體重動物BALB/c小鼠動物B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體骨髓瘤細胞：壽命長雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體單克隆抗體B淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體單克隆抗體聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨髓瘤細胞融合HAT培養基的選擇培養：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤

細胞系單克隆抗體生成：接種雜交瘤

細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體雜交瘤技術原理聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細

胞與小鼠骨流程流程RPM1640培養液DMEM培養液培養液RPM1640培養液培養液PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑作用機理：誘導細胞膜上脂類物質結構重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合作用特點：隨機發生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同細胞融合劑PEG:分子量4000的PEG是最常用的細胞融合劑細胞融合次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶胸腺嘧啶核苷激酶HGPRT酶與TK酶次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶HGPRT酶與TK酶H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNAHAT培養基H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤HAT培養基8-雜氮鳥嘌呤聚乙二醇應用液8-雜氮鳥嘌呤應用液不產生Ig的重鏈和輕鏈HGPRT-;TK-與提供淋巴細胞的動物品系相同骨髓瘤細胞系的選擇不產生Ig的重鏈和輕鏈骨髓瘤細胞系的選擇SP2/O:HGPRT-，TK-;長命淋巴細胞:HGPRT+，TK+;短命(7天)雜交瘤細胞:HGPRT+，TK+;長命骨髓瘤細胞、淋巴細胞與雜交瘤細胞SP2/O:HGPRT-，TK-;長命骨髓瘤細胞、淋淋巴細胞：不能生長，5-7天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷骨髓瘤細胞：不能生長，5-7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻HAT選擇作用淋巴細胞：不能生長，5-7天死亡；DNA合成的主要途徑被A長期生長繁殖。利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA，從淋巴細胞獲得產生某種抗體的遺傳信息從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力

雜交瘤細胞長期生長繁殖。

雜交瘤細胞有限稀釋法顯微操作法FACS法半固體瓊脂糖法克隆化有限稀釋法克隆化特點：不需任何特殊設備克隆出現效率高實驗室常用方法方法：細胞懸液通過系列稀釋每個培養孔含0.5～1個細胞有限稀釋法特點：有限稀釋法效率最高價格昂貴FACS效率最高FACS配制方案：雜交瘤細胞（1～5x106/ml)+細胞凍存液(30%-40%牛血清，50%-60%RPMI-1640培養液，10%DMSO)“慢凍”：分步冷凍，30℃→-70℃→液氮

“快融”：取出立即浸入37℃-40℃水浴中，使其迅速融化、復蘇雜交瘤細胞的凍存與復蘇配制方案：雜交瘤細胞（1～5x106/ml)+細胞凍存液防止污染避免染色體丟失防止非分泌細胞的過度生長防止細胞密度過高而死亡細胞冷凍的意義防止污染細胞冷凍的意義第二節單克隆抗體制備第二節單克隆抗體制備選擇對數生長期的細胞進行傳代培養細胞形態：渾圓、透亮、均一、排列整齊避免細胞返祖：定期用8-AG處理細胞注意事項：切忌過多傳代培養，可將細胞分裝凍存于-80℃或液氮及干冰中培養骨髓瘤細胞選擇對數生長期的細胞進行傳代培養培養骨髓瘤細胞1×108

淋巴細胞無菌手術免疫脾細胞的制備1×108淋巴細胞免疫脾細胞的制備細胞密度過低不利于細胞生長繁殖常用小鼠腹腔細胞作飼養細胞其中MQ還有清除死亡細胞的作用飼養存活一般不超過2周，不影響雜交瘤細胞的純化采取飼養細胞細胞密度過低不利于細胞生長繁殖采取飼養細胞。飼養細胞。飼養細胞骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)50%PEG1min內加完;2min內加10ml培養液融合方法骨髓瘤細胞與淋巴細胞(1:3)融合方法SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2-51ml50%的PEG（無菌，預溫37℃）在1分鐘內滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養液一滴一滴加入,停止PEG作用根據細胞數量加入HAT培養基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數為0.5-1.5×105個。融合后7天，換用HT培養液。細胞融合SP2/0細胞與脾細胞的比例為1：2-5細胞融合10~20天出現克隆HAT篩選挑克隆融合細胞的早期培養10~20天出現克隆融合細胞的早期培養可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法細胞、亞細胞結構上的抗原：免疫熒光法（用丙酮和甲醇按1:1比例固定細胞）篩選常用方法可溶性抗原：ELISA抗體捕獲法篩選常用方法ELISAELISAELISAELISA多頭加樣槍多頭加樣槍。免疫熒光法。免疫熒光法體外培養中空纖維培養系統

單抗含量不高，牛血清Ab難以去除動物接種每次用BALB/c或F1代小鼠，5-10╳105/只

生產單克隆抗體體外培養生產單克隆抗體

細胞性抗原：1-2×107/只，不加佐劑，2-3周重復一次可溶性抗原：首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，3-6周100-200微克抗原，融合前3天，加強免疫免疫小鼠細胞性抗原：1-2×107/只，不加佐劑，2-3周重復腹腔注射法腹腔注射法前5天進行,預先腹腔注射pristane1~5×106細胞1~3w形成腹水高滴度腹水前5天進行,預先腹腔注射pristane高滴度腹水鹽析沉淀親和層析離子交換層析McAb的純化鹽析沉淀McAb的純化Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法特異性測定：抗原類似物的交叉反應效價測定：用腹水或培養液的稀釋度表示

表位測定：幾株單抗是否為不同表位特異的,用競

爭抑制法，相加指數法及微機集群分析親和性測定：測定親和常數K雜交瘤細胞染色體：秋水仙素裂解法，小鼠B細胞染色體40條，SP2/0細胞68條，雜交瘤細胞一般100多條McAb靶抗原分子量：常用westernblotMcAb的鑒定Ig類型、亞類測定：雙擴法或ELISA法McAb的鑒定

McAb

PcAb

抗原要求可以不純純度高得量高低特異性高低穩定低高沉淀反應無有成本高低McAb與PcAb的比較McAbMcAbandPcAbMcAbandPcAb第三節基因工程抗體第三節基因工程抗體

根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進行切割、拼接或修飾后導入受體細胞進行表達，產生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價抗體和雙特異性抗體。基因工程抗體

Geneticengineeringantibody根據研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區框架中，產生的抗體稱為CDR移植抗體將小鼠Ig基因敲除，轉染人Ig基因，在小鼠體內產生人Ab，再經雜交瘤技術，產生大量完全人源化抗體人源化抗體將小鼠的CDR序列移植到人抗體可變區框架中，產生的抗體稱為C方法：從雜交瘤細胞分離出功能性可變區基因，與人Ig恒定區基因連接，插入適當表達載體，轉染宿主細胞，表達人-鼠嵌合抗體特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性保留了親本抗體特異性結合抗原的能力嵌合抗體chimericantibody方法：嵌合抗體chimericantibody嵌合抗體人抗體V區的骨架區取代鼠源單抗CDR以外骨架區改型抗體reshapedantibody人抗體V區的骨架區改型抗體定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（CDR）序列改換成鼠源單抗CDR序列。重構成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構型抗體”，因其主要涉及CDR的“移植”，又可稱為“CDR移植抗體意義：多種特異的鼠源單抗有可能應用于臨床治療改形抗體（RAb）定義：指利用基因工程技術，將人抗體可變區（V）中互補決定簇（

Fab：抗原結合片斷

Fv：可變區片段

ScFv：單鏈可變區片段小分子抗體Fab：抗原結合片斷小分子抗體小分子抗體小分子抗體其它生物活性蛋白融合抗體融合蛋白其它生物活性蛋白融合抗體融合蛋白

許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上的兩個表位交聯或使兩個抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞表面分子的抗體連結在一起，可使效應細胞更容易與腫瘤細胞結合識別，取得殺傷腫瘤細胞的作用。雙特異性抗體許多抗原抗體反應要求雙價的抗原結合位點，使抗原分子上的兩個化學交聯BsAb分別分離純化兩種不同的McAb，使各抗體解離為單價抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價抗體通過化學試劑交聯起來，然后分離出目的組分。此法缺點是容易導致抗體失去活性，產物均一性不佳。基因工程BsAb多采用抗體分子片段,如Fab,Fv或ScFv,經基因操作修飾后,或體外組裝為BsAb,或直接表達分泌型的BsAb。雙特異性抗體化學交聯BsAb雙特異性抗體細胞工程BsAb將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細胞進行再次融合，產生四源雜交瘤(quadroma)。但二次雜交瘤細胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機組合物。BsAb在其中的比例可為10%～50%不等。多倍雜交瘤細胞的穩定性差，BsAb的產量少且活性低，費時費力，臨床應用時存在人抗鼠抗體免疫反應(HAMA)，因此不適用于臨床。雙特異性抗體細胞工程BsAb雙特異性抗體定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進行表達，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術可以得到完全人源性的抗體，在HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨特的優越性噬菌體抗體庫技術定義：將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉染工程細菌進用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達在其外殼表面用抗原抗體反應篩選出表達所需要抗體的克隆并擴增。使抗體基因以分泌的方式表達，獲得可溶性的抗體片段。抗體庫：組合抗體文庫：在建庫過程中如果將VH和VL隨機組合人天然抗體庫：抗體mRNA來源于未經免疫的正常人

基本原理

用PCR擴增人抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因噬菌體抗體庫噬菌體抗體庫①從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并逆轉錄為cDNA；②應用抗體輕鏈和重鏈引物，根據建庫的需要通過PCR技術擴增不同的Ig基因片段；③構建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有λ噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構建表面表達的噬菌體抗體庫(surfacedisplayantibodylibrary)常用載體；④表達載體轉化細菌，構建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附-洗脫-擴增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。

構建噬菌體抗體庫①從外周血或脾、淋巴結等組織中分離B淋巴細胞，提取mRNA并模擬天然全套抗體庫抗體文庫可以達到或超過1011庫容,能包含B細胞全部克隆建庫的外源基因來自人體多克隆細胞的總mRNA通用引物具有人的種屬普遍性抗體的VH和VL基因的隨機