第二十一 細胞凋亡及其調控的分子機凋亡是種自然現細胞凋亡的細胞凋亡（)-形態學概念或程序性細胞 （medcelldeath,PCD）---功能性名第一細胞凋亡的特征及生物學意一、細胞凋亡的基本特(一)形態學特點(多階段細胞體積： 為碎片（核碎片形成）細胞胞質：出現空泡，脫水濃縮，體積減少約細胞器：光鏡下的形態學特

凋亡細胞與鄰近細胞分光鏡下結 熒光顯微鏡下結

呈新月形的凋亡細凋亡小體(apoptoticbody)的形含有細胞質膜、細胞器及核碎片的膜包被小體形成細胞表面突起形成------ 膜融合、根部縮→脫分隔機 在凋亡細胞內由內質網分隔成小不等的分隔區，靠近細胞膜端的分隔膜與細胞膜融合并脫落形成凋亡小體。(3)自噬體形成機 凋亡細胞內線粒體質網膜形成自噬體，自噬體在與凋亡稱凋亡小體。在性肝炎中見到的嗜酸空泡 固

出 邊 凋亡時細胞的

凋亡小透射電鏡下的凋亡小

（二）細胞凋亡的生化特 段化（主機制DNA 其它胞漿Ca2和H+水凋亡的發生伴隨胞漿Ca2+和H+水平的升高細胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)外膜磷脂的不對稱性分布改變,凋亡PS由質膜內側翻向外側（早期特征線粒transmembranepotential,Δψm)下降；膜通4）大分子合成：（三）細胞凋亡與壞死的區別-細胞凋細胞壞誘導因生理性、弱刺激強烈刺細胞數單個細胞丟成群細膜完整保持至晚早期即喪細胞早期固縮、斷晚期破細胞無明顯變腫胞內容無釋釋細胞凋亡與壞死的區別-細胞凋細胞壞核片組大分子合一般需不需調有無不引起炎癥反引起炎癥反意生理病理二、細胞凋亡對于多細 發育至關重與DNA第二細胞凋亡的發生機一、細胞凋亡的酶學基秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis凋亡活 ：ced-3ced-凋亡抑 ：ced-Ced-4--凋亡活化因子1(apoptosis-factor-1,Apaf-（一 與細胞凋CaspaseCaspase(Cysteinylaspartate-specific是一類與白介素-1?轉化酶/Ced(ICE/Ced)同源的一類半胱氨酸蛋白酶活性位點含有保守的aa序列(QACXG,X為以無活性的 式合成并存在于細胞中可以被上游或自身切割保守的活化；已在哺乳類中發現18種，分為3 ，Caspase-2 （-3、-6、-7、-8、-9、-亦可根據前體分子(procaspaseN端的原構域(pro )分為類:啟始分子(initiator)：具“Long- 如-8、-9、-10等，為蛋白酶級聯反應的啟始者，其活化后再切割和活化下游spase；效應分子(efftor)：具“t-pro ，如-3、-6、-7等，作為上游酶的底物被切割活化，再作用于多種蛋白質或酶，促使細胞凋亡。根據在級聯反應上、下游的位置及功能的不同，可分為三大類①凋亡始動子，位于級聯反應上游，包括、、、等，能在其他蛋白參與下發生自我活化并激活下游的。③包括、、-pas、、，主要參與細胞因子介導炎癥反應并在 受體介導的細胞凋亡途徑中起輔助作用。 的蛋白酶系統，在細胞凋亡機制網絡中居Caspase原結構 大亞 小亞N D175異二聚體異四聚體蛋白酶活CaspaseActivationby

ActiveCaspase轉活化（transacti-非Caspase蛋白酶活化（activationbynoncaspaseproteinases）自活化：酶原具有很低的蛋白水解活性，表明它在某種條件下有自活化的潛力。野生型的過表達可導致酶原的加工與激活。轉活化：一旦被激活，起始能轉活化其他的酶原，包括效應和起始。非蛋白酶活化酶原的另一激活機制是直接被其他非蛋白酶所活化。如，細胞毒性T細胞的顆粒酶B是一種天冬氨酸特異的絲氨酸蛋白酶，是酶原和的高效激活劑。效應caspase非凋亡細胞中,caspase活化的DNase與其抑制蛋白(ICAD)結合凋亡細胞中,caspase剪切在凋亡過程中caspase在單一位點剪切核纖層蛋白(lamin),導致核板塌陷,染色質濃縮.聚（腺苷二磷酸-核糖）多[Poly(ADP-ribose)polymerase,Caspase8,10,pathway:9Caspase3,and

Poly(ADP-ribose)(二)介導細胞凋核酸內切酶主要是DNase包括DNaseDNase 二、細胞凋亡的信號傳遞途細胞凋亡的影響信號分為2類一類為凋亡的負調控信號（抑制凋亡另一類為凋亡的正調控信號（誘導凋亡）細胞各種因素引起的凋亡的形態與生化改變均相同 細胞為結束，從而使細胞凋亡得以完（一 受體介導的細胞凋 受體(deathreceptors,DR)：定義：指細胞表面存在的一類能結合凋亡剌激分子并將信號傳遞至胞內引起細胞凋亡的受體。組成：胞外區（富含Cys結構域、保守結構域(death ,DD)分類：目前已發現近十CD95(Fas/Apo1)、TNFR1、TNFR2DR3(Apol3/Esl1)等 結構域” ,概念：是凋亡信號受體共有的、存在于胞內的誘導細胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。種類Fas相關 結構域(Fas-associatedFADD包含DD 效應結構域（death, 結構域(TNFreceptor-associateddeath 受體相互作用蛋白(receptorinteractingprotein, 功能：DD的活化或過表達都會導致細胞凋亡死體死體信形成合

DDD

DD活活活活活NF-?B,AP- 活促進炎癥免疫反應

效應Caspase活化級聯放大反 細胞凋（二）線粒體相關蛋白的凋亡Δψm的維持，與（mitochondrialpermeabilitytransitionpore,幾乎所有誘導劑引起的細胞凋亡都伴線粒體跨膜電位(ψm的下降;幾乎所有的凋亡誘導因素導致MPT破壞或開放 ：Δψm下降、氧化磷酸化脫偶聯、GSH耗竭、活性氧簇（reactiveoxygenspecies，線粒體釋放的凋亡誘導分子在多種誘導因子（如UV照射）作用下，MPT開放(cytochromeCCytC)SmacAIF、EndoGCytC釋放到胞質中的CytC，可特異性地結合接頭蛋白Apaf-1借助N-端caspase（CARD）,直接募集多個caspase-9并使之活化 凋亡（三）內質網介導蛋白的合成、修飾和折疊，導致下游CaspaseCaspase-12存在于內質網膜（如內質網鈣離子內環境紊亂）誘導的凋亡所必需的。當內質網鈣離子動態平衡破壞或過多蛋白積聚于內質網時，可直接激活位于內質網上的。同時也導致胞質中的轉移到內質網表面，進一步激活，激活的可進一步剪切pas，而 細胞凋亡。此過程由內質網失常引起，與以膜或線粒體為靶位點的凋亡信號觸發無關。（四）粒酶B介導的細胞凋細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicT 粒酶（Granzyme,Gr）是CTL和NK細胞 先以 式合成，受刺激后激活已發現5種：GrA、B、H、M和類胰蛋白酶-其中以GrBGrB誘導細胞凋亡的途徑 在體外，proe 中，除1外其余的都可被GrB切割活化，0和7是GrB的最適底物； 參與，與線粒體膜通透性及Δψm有關胞胞粒酶B

受

凋亡主要途激激活

Cyt起始

效應

底底PARP、Lamin、PK、DNA-細胞凋DNA斷裂、細胞細胞凋第三細胞凋亡的調（一）P53蛋白的調控作P53的結構C-端的26aa構成一個開放的結構域P53正常胞漿P53胞內P5被嚴格 :受tofMdm2)（主要）和的負反饋調節，通過泛素降解途徑調節P53水平。異常情況下：當細胞A損傷、紡錘體絲斷裂、癌 異常表達等細胞生存 時P53水平迅速升高和活化。P53野生型P53蛋白 如果損傷不能修復，P53就激活那些誘導凋亡 突變型P53蛋白喪失抑制細胞惡性增殖功能 突變50%以上腫瘤逃逸凋亡的重要原因本身具有 功能P53蛋白— 衛DNA損

因子P53P53P53P53蛋細胞停滯于G細胞停滯于G1

P53蛋白 制解鏈(二)Bcl- 蛋白的調控作成 可能存在的聚合體形 bcl- Bcl-2/Bcl- Bax/Bcl-凋 bcl- Bcl-xL/bcl-xLBcl-2/Bcl-凋 Bax/Bcl-凋 bcl- Bcl-xS/Bcl- Bcl-xS/Bcl-凋 Bad/Bcl- Bad/Bcl-Bcl- region,TM)——Bcl-2定位內膜所必需Bcl-2同源結構(Bcl-2homology據結構特點分為三個 ：Bcl-2、bcl-xL等，促進細胞存至少含BH1、2或全部四種 ：Bax、Bak含BH1、23，促進凋 ：Bik、Bad、Bid僅含BH3 Bcl-2、Bax和Bcl-x組成一個凋亡調控當同源二聚體形成時，便誘導細胞凋亡；隨表達量增加，漸多的解聚，形成更穩定的2異源二聚體，從而中和了“x”誘導凋亡的作用。即和2比值調節凋亡；當Bcl-xS存在時，優先形成Bcl-xS/Bcl-2，PossibleModeofbcl-2s（白藜蘆醇）誘導鼻咽癌E2Z細胞凋亡的可能機制 sveratolBcl-2的蛋白水釋放CytC入胞漿

Caspase-9酶 活化的Caspase-Caspase-3、-6細胞凋第四檢測細胞凋亡的常一、凋亡的形態學檢查（光鏡、電鏡蘇木素 （HE）染色法甲基綠—派諾寧染色法Giemsa染色法瑞氏(Wright)染色AO-EB染色法（吖啶橙–溴化乙啶透射電子顯微鏡觀察HE染色嗜酸性變及嗜酸性小肝細胞體積縮小，胞漿濃縮紅染，呈嗜酸性變；或胞漿進一步濃縮，細胞變圓，核碎裂、溶解 ，呈嗜酸性小體狀甲基綠-派諾寧染色AO-染色Humanlymphomacellstreatedwiththechemotherapyagentcamptothecin（喜樹堿正常細二、熒光顯微鏡觀察吖啶橙染色法Hoechst染色染色

三、凋亡細胞的生化特征的檢（一）瓊脂糖凝膠電泳 axel axel BCap37BCap37MCF7(二)原位末端標記技(insituend–labeling,原理:凋亡時斷裂，利用末端A轉移酶（TdT）或A聚合酶將帶有生物素（或熒光素）標記的核苷酸（biotin-16-）摻入到斷裂的A的3’端，再使其與帶有的親和素蛋白結合，經顯色后，可觀察到細胞內是否存在N 段。主要方法有3種原位缺口平移法（ISNT）：DNA聚合酶I介原位末端標記法：klenow大片段介TdT介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)：該法特異性和敏感性較高，可檢出早期的凋亡細胞ISNTandTUNELTUNEL鑒定的原理基于細胞凋亡時產生DNA斷鏈，所介導的酶是TdT，該酶能將外源性的生物素或地高辛標記的dUTP無需DNA模板連接到凋亡細胞核的DNA斷鏈的3-羥基(3'-0H〉末端，DNA斷鏈可是單股斷鏈也可是雙股斷鏈，兩種斷鏈都有游離的3'-羥基末端，因此，TUNEL鑒定可以檢測凋亡細胞核中的單股和雙股DNA斷鏈。蘇木素染色-四、凋亡細胞的流式細胞術檢基本操作步驟離心收集細胞---重懸于70%乙醇20℃固定24小時離心后重懸細胞PBS緩沖液---加碘化丙啶（imiodide,P）染色(含aA),37保溫30mi流式細胞術分析亦可用PI/Hoechst雙染通過亞二倍體峰（亞G1峰）---（apoptoticpeak,AP)的有無及面積積分來流式細胞術 ysisofapoptoticpeak(Ap)byflowcytometryaftertreatmeatwithHHTfor8h B：1μg/mlHHT流式細胞術

五、磷脂酰絲氨酸（PS）外翻分析（Annexin法nV是一種分子量為D的C2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將nnV進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的nV作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種酸，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將nV與P匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。六、線粒體膜勢能的檢 如Rhodamine123、DiOC6、TMRM等可結合到線粒體基質，七、Caspase-3活性的檢在凋亡的早期階段，Caspase-3被激活， 例如：Westernblot分析Procaspase-第六細胞凋亡與疾細胞凋亡與疾病發與細胞凋亡不足有 與細胞凋亡過度有 淋巴P53突變依賴于激素引起的2自身免疫性疾病免疫介導的腎小管腎

老年癡再生 貧缺血性損肝免疫排斥反 （一）細胞凋亡不足引起的疾自身免疫性疾正常異常巴細胞被激活，產生大量的效應細胞靶發病的分子機制淋巴細胞中調節細胞凋亡的一個關鍵分子是細胞表受體Fas（又稱APO或CD95）Fas受體與Fa