蛋白質的提取與檢測第一節細胞總蛋白的提取及含量測定【基根源理】蛋白質含量測定法是生物化學研究中最常用、最基本的解析方法之一。目前常用的有四種經典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸取法。其他還有兩種近來幾年寬泛使用起來的測定法，即考馬斯亮藍法（Bradford法）與二辛可寧酸法（BCA法）。值得注意的是，上述方法其實不能夠在任何條件下適用于任何形式的蛋白質，由于一種蛋白質溶液用這幾種方法測定有可能得出不相同的結果。每種測定法都不是完滿無缺的，都有其優缺點。在選擇方法時應試慮：①實驗對測定所要求的矯捷度和精確度；②蛋白質的性質；③溶液中存在的攪亂物質；④測定所要開銷的時間。Lowry法：蛋白質與堿性銅溶液中的二價銅離子絡和使得肽鍵伸展，從而使裸露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與磷鉬鎢酸反應并產生深藍色，在750nm有最大光吸取值。在必然濃度范圍內，反應液顏色的深淺與蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各種蛋白質中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測準時需使用同種蛋白質作標準。Bradford法：蛋白質與染料考馬斯亮藍G-250結合，使得染料最大吸取峰從465nm變為595nm,溶液的顏色由棕黑色變為藍色。在必然的線性范圍內，反應液595nm處吸光度的變化量與反應蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進行蛋白定量。BCA（Bicinchoninicacid）法：二價銅離子在堿性的條件下，能夠被蛋白質還原成一價銅離子（Biuretreaction）并與BCA相互作用產生敏感的顏色反應。兩分子的BCA螯合一個銅離子，形成紫色的反應復合物。該水溶性的復合物在562nm處顯示強烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在寬泛范圍內有優異的線性關系，依照吸光值能夠計算出蛋白濃度。試劑配制】1.1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF:0.174gPMSF溶解于100ml異丙醇，分裝于1.5ml離心管中，-20C保存。12.細胞裂解液:50mMTris-HCl(pH7.4)，150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA,1%TritonX-100,4°C保存。3.100mg/ml牛血清白蛋白(BSA):BSA0.1g,0.15mol/LNaCI1ml，充分溶解后-20C保存。0.15mol/LNaCl:0.877gNaCl溶解于100ml去離子水，高溫滅菌后室溫保存。5.考馬斯亮藍G250溶液：考馬斯亮藍G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸100ml，加去離子水至1L。先用乙醇溶解考馬斯亮藍染料，再加入磷酸和去離子水，混勻后濾紙過濾，4C保存。6.PBS緩沖液(pH7.4):NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4?12WO3.63g,KH2PO40.24g,溶解于900ml雙蒸水中，用鹽酸調pH值至7.4，加去離子水定容至1L，常溫保存備用。【操作步驟】一、細胞總蛋白的提取1.人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231與食道癌細胞系EC109于含10%FBS的DMEM培養基，37C、5%CO2條件下老例培養。2.去除培養液后以預冷的PBS沖洗2?3遍。3.加入適合的預冷的裂解液后置于冰上20?30min,不時搖動。4.用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側，轉移將細胞碎片和裂解液至預冷的1.5ml離心管中；。5.4C、12000rpm離心15min。將上清分裝至1.5ml的EP管中，-20C凍存備用。、蛋白含量測定（BCA法）（碧云天P0012）依照樣品數量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50:1）配制適合BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24小時內牢固。2.完好溶解蛋白標準品，取10uL稀釋至100uL，使終濃度為0.5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡略起見，也能夠用0.9%NaCI或PBS稀釋標準品。3.將標準品按0,1,2,4,8,12,16,20uL加到96孔板的標準品孔中，加用于稀釋標準品的溶液補足到20uL。24.加適合體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標準品的溶液（PBS）到20uL。每個樣品三個重復。5.各孔加入200uLBCA工作液，37C放置30分鐘。也能夠室溫放置2小時，或60C放置30分鐘。BCA法測定蛋白濃度時，吸光度會隨著時間的延長不斷加深。而且顯色反應會因溫度高升而加快。若是濃度較低，適合在較高溫度孵育，或延長孵育時間。6.酶標儀測定A562,540-595nm之間的波長也可接受。依照標準曲線計算出蛋白濃度。標準品OD值0.0780.0990.1180.1540.2130.2830.329第二節SDS電泳【基根源理】SDS電泳技術(SDSpolyacrylamedegelelectrophoresi)s第一在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn進一步完滿。當在樣品介質和聚丙烯酰胺凝膠系統中加入SDS后，則蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量大小，其他因素能夠忽略不計。SDS是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質分子之間以及其他物質分子之間的非共價鍵(氫3鍵和疏水鍵)。在強還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)的存在下，蛋白質分子內的二硫鍵被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質分子或其亞基與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物，復合物所帶的負電荷大大高出了蛋白質分子原有的電荷量，這就除掉了不相同蛋白質分子之間原有的電荷差異，蛋白質-SDS復合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。橢圓棒的短軸對不同的蛋白質-SDS復合物基本上是相同的，但長軸的長度則與蛋白質分子量的大小成正比，因此這種復合物在SDS系統中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度即蛋白質分子量的大小。當蛋白質的分子量在15?200kD之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。因此，SDS不但能夠分別判斷蛋白質，而且能夠依照遷移率大小測定蛋白質的分子量。【試劑配制】1.10%SDS:10gSDS加入100ml去離子水中，50C水浴下溶解，室溫保存。2.1.5mol/LTris-HCl(pH8.8):Tris-base45.43g,加入200ml去離子水溶解后，用濃鹽酸調pH至8.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。3.1.0mol/LTris-HCl(pH6.8):Tris-base30.29g,加入200ml去離子溶解后，用濃鹽酸調pH至6.8，加去離子水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。4.電泳緩沖液：Tris-base3.03g,Glycine18.77g,SDS1g，加入適合去離子水溶解后定容至1L，室溫保存。45o$o5-*044自R-oDo&3-0ldo.2.2.OO5DD單-5<dDCZD..4S<ri115

5.5XLoadingbuffer：50%甘油，250mMTris-HCI（pH6.8）,10%3■巰基乙醇，2.5%。溴酚藍，10%SDS。混勻后，分裝于1.5ml離心管中，4C保存。6.10%過硫酸胺（AP）：0.1g過硫酸胺溶解于1.0ml去離子水，4C保存，保存時間為2周。四甲基乙二胺（TEMED）:分裝少量原液于棕色瓶，4C避光保存。8.30%Acr/Bic（37.5:1）:丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉雙丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入適合去離子水于37T下充分溶解并定容至100ml，4C保存。注意：Acr/Bic均擁有毒性，易吸附和積累，應戴手套進行操作。9.凝膠脫色液：500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去離子水定容至1L，室溫保存。考馬斯亮藍G250蛋白染色液：0.1g考馬斯亮藍G250溶解于100ml脫色液中，混勻后濾紙過濾去除顆粒性物質，置于棕色瓶中室溫保存。凝膠保存液：450ml脫色液中加入50ml甘油，混勻后室溫保存。12.SDS濃縮膠(5%Acrylamide)配方:13.分別膠配方衿斡蔓證越粗所討應罰齊押組巒釣le樣■S%Gal首冋10mlIfimi20rrrfmlfflml4Qml陰ml6307.?居衛scs136%鳧:fyl*m禹Gsa.sac.a4叮15-&.1B丁1.5.1TrBdUClipHSB?o.o□Inld2.#0.o.9DB且10%3DS33歸so&au>11]JFMII-adDmcdQo5”TEMEDa%Gsio10oHzO30*-AcfylhOlS2-5.TJ1.5MTrHh>Cl(pH?.eiB2BPQ%SD￡33Q2o帕九墳曲ft?r.宜2TEMEDo遼90<.&25O1FEEDHzO:593C雖屁「yl白filide﹁■ISMT.B-HCliphUBm￡dJ!□SDSo.■so535g過瞇蝮?r25了?aTEMED01o0312%G?I2[HbOl,6334.9石2o930氣:恥iyl曰midiB◎2d4.0B.DgIBMTiEHCNpH?e)10%卞53了IS?53B00'fl-o533SDS二D.05CMQISr-L.2^EMEOiS^GalD.05D.1ais里D.0040DH0QM0.01)0.012fl.OIS*02HaQ30%.Acrplarnicfe1.1?3^44-6了asg.21.5MTii-HCHpHfl.&SS.5i.a7.5IM5.3150WSDS0.0aT5i3tfiSrtSIS&0②7-SD.as0.2-2STEMEDD.0323.1Q150.30.40-2C1MMC.1&o.ooa0.3DJ516各膠丼粗所吋底的Wfitf-時電til?1UM2ml3ml4ml5MlBmil8mi10mlHsOo.eo14?1273.44.1556030%Mryl.mlg0J30.50.67O.f31.0121.7■H1.0MT?lt-HCltpH6.8k0.750130￡5038050631012510%SDSOOi0尬臨0.040.050.060.0ft0.110%過現墟袪Q.QI0.20.030.040.06Q1TEMED00K0<KUOCXMOOM0.M60.009tl&lO.OOT5操作步驟】、凝膠的配制與電泳1）凝膠配制與上樣玻璃板對齊后放入夾中卡緊。爾后垂直卡在架子上準備灌膠。2.配制10%濃度的分別膠，加入TEMED后馬上搖勻即可灌膠。灌膠時使膠沿玻璃板流下省得膠中有氣泡產生，待灌入2/3的分別膠后應馬上封膠，用水飽和的異丁醇或異戊醇，也能夠用0.1%的SDS。膠充分凝固即可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配制5%濃度的濃縮膠，將節余空間灌滿后馬上將梳子插入濃縮膠中；插梳子時要使梳子保持水平，濃縮膠凝固的過程中要補膠1?2次。5.待到濃縮膠凝固后，豎直向上輕輕拔出梳子，用水沖洗一下濃縮膠，將其放入加有電泳緩沖液的電泳槽中。6.取出含50^g白樣品與5XLoadingbuffer按比率充分混雜，煮沸5min。加足夠的電泳液后用微量加樣器貼壁上樣，注意不要吸進氣泡。2）電泳1.以初始電壓為80V進行電泳,30min,樣品進入分別膠后改為120?150V。2.在溴酚蘭泳動至距膠下緣約1cm時即可停止電泳（目的蛋白條帶一般跑過分別膠的1/3,可依照預染蛋白Marker調整電泳時間）。、考馬斯亮藍染色1.電泳后的凝膠于染色液中振蕩染色4h或40C染色1h,爾后用蒸餾水將凝膠淋洗一次。多次變換脫色液直至凝膠背景脫凈為止，為加快脫色，可略加溫度。3.凝膠保存：脫去背景色的凝膠在保存液中浸泡30min,爾后將凝膠放在玻璃板上，用保存液浸潤玻璃紙包住凝膠在室溫下干燥即可。6第三節免疫印跡（WesternBlot）【基根源理】WesternBlot中文一般稱為蛋白質免疫印跡，是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基根源理是經過特異性抗體對凝膠電泳辦理過的細胞或生物組織樣品進行著色。經過解析著色的地址和著色深度獲得特定蛋白質在所解析的細胞或組織中的表達情況的信息。WesternBlot與Southern印跡雜交或Northern雜交方法近似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經過PAGE分其他蛋白質樣品，轉移到固相載體（比方硝酸纖維素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜）上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分其他多肽種類及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色、化學發光或放射自顯影以檢測電泳分其他特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也寬泛應用于侶一転小時檢測蛋白水平的表達。在眞上固定珀陽育底韌f如為S-gfen貝4直鏤孵育至品住嗣可）7分鐘【試劑配制】1.電轉液：Tris-base5.8gGlycine2.9g,SDS0.37g,甲醇200ml，去離子水定容至1L,室溫保存。2.TBS:20mMTris-HCI（pH7.4）,150mMNaCI，室溫保存;3.TBST:即含0.05%Tween20的TBS緩沖液。關閉液與抗體稀釋液：均為含5%脫脂奶粉的TBST，溶解后4C保存。【操作步驟】、轉膜將PVDF膜在甲醇中浸泡3min,完好浸潤后置于入轉膜液中。2.將膠平鋪于海綿上，按圖示序次鋪上膜與每側1?2張濾紙，注意用玻璃棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分。cjiiwid*IRMVAW+++++++++從負極（黑色板）依次鋪海綿-濾紙（3層）-膠-PVDF膜-濾紙（3層）將夾子放入轉移槽中，要使夾子的黑面對轉移槽的黑面，夾的白面對紅面。將轉移槽置于冰水混雜物中，300mA,1.5h（同時放入冰袋，外面包冰）以預染蛋白Marker觀察轉移收效。注意：①轉移液含甲醇，操作時要戴手套；②整個操作均在轉移液不中斷進的行搟，去要氣泡；8③膜兩邊的濾紙不能夠相互接觸，接觸后會發生短路；④注意轉膜時電極方向是“膜正膠負”。9、免疫反應1.關閉：將PVDF膜從電轉槽中取出，去離子水與TBST略加漂洗，吞沒于關閉液（脫脂奶粉5%）中緩慢搖蕩2h。傳統上有兩種關閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能夠用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白自己就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結合磷酸化抗體從而易產生高背景。某些抗體用BSA關閉時因不明原因可能會產生比脫脂奶粉更強的信號。2.結合一抗：將B-Actin—抗（兔抗人、鼠）用關閉液稀釋至適合濃度（1:2000）,室溫下作用2h或4C過夜。3.沖洗：TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次，每次5?10min。4.結合二抗：按適合比率（1:5000）稀釋HRP標記的二抗（羊抗兔），室溫作用2h。沖洗：TBST漂洗膜后再浸洗2次，每次5?10min。DAB顯色（按產品說明書操作）二氨基聯苯胺（3,3'-diaminobenzidine,DAB）是過氧化物酶HRP（Peroxidase的生色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而表現出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產物。用于檢測過氧化物酶的活性，矯捷度高，特異性好。其適用于蛋白質雜交和免疫化學，以及原位雜交染色等。-22175將配好的DAB直接滴加在目的片段地址，避光顯色至-80蛋白目的條