目的與要求掌握DNA測序的一般原理和方法，通過學習，分析DNA策序與蛋白質策序的區別。重點：

Sanger雙脫氧鏈終止法策序原理和方法難點：如何根據凝膠電泳直接讀出DNA序列學時：2學時學習方法：課堂講授與討論相結合第一頁，共三十頁。2.3.1Sanger雙脫氧鏈終止法■

2.3.2Maxam－Gilbert化學修飾法■

2.3.3序列分析自動化■2.3.4雜交測序■2.3.5DNA策序的商業運作及存在問題■2.3.6思考問題■第二頁，共三十頁。2.5.1Sanger雙脫氧鏈終止法60年代末就已掌握了充分的理論知識，只是當時在某些技術能力上和研究思路上，存在著弱點，阻礙了從理論轉變為現實。第一，如何分離寡核苷酸片段；另一方面，在研究思路上都沒有擺脫蛋白質序列分析的束縛。1965，Cornall大學以S．W．Holle，為首的科學家小組，首次完成75個核苷酸的酵母丙氨酸tRNA的全序列測定。即利用各種RNA酶把tRNA降解成寡核苷酸，經分離純化后，再分別測定短片段順序。返回DNA核酸序列分析歷程第三頁，共三十頁。1968年華裔生物化學、生物學家吳瑞博士（Dr．RayWu）獨創性地設計出一種嶄新的引物一延伸測序策略，并于1971年首次成功地測定了λ噬菌體兩個COS末端的完整序列；1977，F.Sanger在該策略的基礎上，發展出了快速測定DNA序列的末端中止法；K.Mullis采納他的方法，完善了PCR擴增DNA的方法；M．Smith發明了堿基定點突變技術。這三位科學家全都獲得了諾貝爾獎。引物—延伸測序策略第四頁，共三十頁。2.5.1.1Sanger雙脫氧鏈終止法原理利用DNA聚合酶的兩種酶催反應特性：1、利用單鏈DNA模板，合成DNA互補鏈；2、利用2’，3’雙脫氧核苷三磷酸作底物，參入到寡核酸鏈的末端，從而終止DNA鏈的生長。有時也稱引物合成法，或酶催引物合成法。第五頁，共三十頁。反應：同時加入引物和模板、DNA聚合酶1、一種ddNTP、以及四種dNTP（有一種帶放射性標記）。變性膠電泳分離反應混合物。放射自顯影術，檢測單鏈DNA片段的放射性帶。結果判讀，從放射性X光底片上，直接讀出DNA的核酸順序。考考你：反應混合物中，標記什么最方便？第六頁，共三十頁。GTACGTTGACGCCddATPddTTPddGTPddCTPddCTPddATPddGTPddTTPAGTCAGGATCACC考考你第七頁，共三十頁。酶、原料比例在實際的DNA合成反應中，使用失去了5’→3’核酸外切酶活性的DNA聚合酶I的Klenow大片段。適當地調整ddNTP和dNTP的比例，便能夠獲得良好的電泳譜帶模式。dNTP／ddNTP=1：100時，譜帶分離效果較佳，可讀出多于200個以上的核苷酸順序。降低ddNTP對dNTP濃度比，會產生逐漸加長的片段，再配合使用長膠和低濃度的聚丙烯酰氨凝膠，分辨能力可提高到能判讀出300個左右的核苷酸順序。dNTP／ddNTP與良好的電泳譜帶模式的關系如何？第八頁，共三十頁。2.5.1.2Sanger雙脫氧-M13體系DNA序列分析法引物合成DNA序列測定法的特點及缺陷分析：這樣處理后，能策得高分子量DNA嗎？為了將這些降解的DNA片段，按其原來的順序“拼排”起來，至少還需要用一種或數種其它內切限制酶，對同種DNA作酶切消化，并進行電泳純化和序列分析。實際上可行嗎？高分子量DNA分子消化降解成一組具一定長度的限制片段，然后再用瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離純化，從膠中抽取DNA片段，供進一步分析。第九頁，共三十頁。這些供作序列測定的DNA片段絕大多數都僅為數百個核酸。因此需要用物理方法分離大量的DNA片段。費時費錢，因為商品提供的核酸內切限制酶的價格是十分昂貴。為了保證能夠獲得所有的限制片段，就需要制備足多數量的DNA，而其中有許多步驟都要用不同濃度的凝膠進行電泳再純化。在這種純化過程中，會加劇DNA的損傷和丟失。第十頁，共三十頁。克服缺點的一種途徑—DNA分子克隆將不同限制酶消化切割的DNA限制片段，隨機地克隆到載體分子上。選用天然的單鏈DNA噬菌體，例如M13作為載體，重組體噬菌體的DNA分子，可直接用作模板。引物：合成的特定的寡核苷酸，或者是從親本單鏈噬菌體DNA中分離出來的一種限制片段。其特點是能夠特異性地同載體分子上與克隆位點相連的單鏈DNA區段雜交。稱做“通用引物”。第十一頁，共三十頁。M13載體克隆DNA片段將DNA片段克隆在M13mp載體特定位點上，即位于Lac區段中含有多克隆位點的多聚銜接物（polylinker）內。重組體噬菌體，在含有IPTG和Xgal的培養基平板上形成白色的噬菌斑，而非重組體的噬菌體則形成藍色的噬菌斑。從白色的噬菌班中分離重組體噬菌體，并制備出單鏈DNA，就可以直接按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。第十二頁，共三十頁。當然這種隨機的方法，也需要通過順序的測定將派生的序列拼連起來，恢復成原來結構形式的總DNA序列。第十三頁，共三十頁。使用M13載體系列的優點所有的待測定的DNA片段，都可以共用一種引物。這樣，就避免了合成和分離各種不同引物的許多麻煩。最初使用的引物，是克隆在PBR322質粒載體上的一種短的限制片段。以后J．Messing等人（1981）發展出了一種更加適用的長度為15bp的合成引物，這段引物同M13的其它位點之間有低度的同源性，后來又合成出了改進的同M13其它任何位點均無同源性的引物。現在，應用M13mp載體系列的雙脫氧鏈終止法，已經成為一種最普遍采用的快速的DNA序列分析法。第十四頁，共三十頁。2.5.1.3Sanger雙脫氧一pUC體系DNA序列分析法自引入M13載體系列，DNA序列分析又有了新的改良和發展。起初是使用Klenow片段，現在則可以使用反轉錄酶或T7DNA聚合酶。以往都是把待測DNA片段克隆到M13mp載體上，得到單鏈模板后，再按雙脫氧鏈終止法進行序列分析。現在，可以將待測DNA片段克隆到質粒載體上，直接用閉合環形的雙鏈質粒DNA按雙脫氧鏈終止法作DNA序列分析。這種方法特稱為利用雙鏈質粒DNA模板的雙脫氧DNA序列分析法。由于通常使用的質粒多是pUC載體系列，所以又稱之為Sanger雙脫氧鏈終止-pUC體系DNA序列分析法。第十五頁，共三十頁。Sanger雙脫氧一pUC體系DNA序列分析法基本步驟待測DNA與pBR322或pUC分子重組；轉化：轉化反應物涂布在補加有Xgal-IPTG選擇性培養基平板上，經37℃過夜培養；挑選白色菌落，制備質粒NA。堿變性處理，與引物一起退火，然后按雙脫氧法作序列分析。優點：無需將DNA克隆到M13載體上，更為簡單快速，現已被許多研究工作者采用。返回目錄第十六頁，共三十頁。2.5.2Maxam－Gilbert化學修飾法是1977年由美國哈佛大學的A．M．Maxam和W．Gilbert

發明的，所以又叫做Maxam－GilbertDNA序列分析法雖然說對于大分子量的DNA片段的序列測定而言，化學修飾法并不如雙脫氧法方便有效，其發展速度也不及后者迅速，但是至今在相當多的研究工作中仍被采用。返回目錄第十七頁，共三十頁。2.5.2.1Maxam－Gilbert化學修飾法的原理化學試劑處理末端標記DNA片段，堿基的特異性切割產生的DNA片段混合物,電泳分離顯影后顯現譜帶，直接讀出待測DNA片段的核苷酸順序。第十八頁，共三十頁。出發材料：局部消化的DNA分子群體中純化出特定的末端帶有放射性標記的DNA片段(雙鏈或單鏈）關鍵：4種核苷酸堿基中，有1～2種發生特異性的化學切割僅應，包括堿基的修飾、修飾的堿基從其糖環上轉移出去以及在失去堿基的部位發生DNA鏈的斷裂三個主要的內容。由于化學切割反應特異性是由堿基的修飾作用決定的，顯然，隨后的切割反應必定是定量的，而且同副反應無關。第十九頁，共三十頁。堿基特異的化學切割反應——肼專用試劑有硫酸二甲脂和肼。肼又叫做聯氨（NH2·NH2），在堿性的條件下，它能夠從C4和／或C6原子位置作用于T和C兩種堿基，并用C4-C5-C6環化形成一種新的5原子環。聯氨的進一步作用釋放出吡唑琳酮環，留下的嘧啶堿基的N1－C2－N3片段則仍然連接在糖環上。在具有六氫吡啶的條件下，通過β-消除反應，2個磷酸分子便會從糖片段上釋放出來，從而導致在這個核苷酸位置上發生DNA鏈的斷裂。反應體系中加入lmol/L濃度的鹽，肼同T的反應速率便會逐漸下降，以確保發生C特異的化學切割反應。根據這一特點區別C和C+T之間的降解產物。第二十頁，共三十頁。硫酸二甲酯［（CH3O）2SO2］在硫酸二甲酯的作用下，DNA堿基環中的氮原子發生甲基化反應（G

N7原子和A

N3原子）。中性PH，甲基化導致配糖鍵水解，留下失去堿基的糖片段作為糖一磷酸骨架上的鍵。這種鍵十分微弱，易于通過堿催化的消除反應使圍繞在糖片段兩翼的磷酸脫落，造成DNA斷裂。由于A

N3原子的甲基化比GN7原子慢，故3-甲基A的配糖鍵比7-甲基G脆弱。所以前者的水解速率比后者快4～6倍。速率上的差別，是早期分析辨別DNA中的G和A的基本依據。最近采用六氫吡啶同DNA甲基化反應，而這種反應對甲基化的G是特異的。因此，DNA鏈的斷裂只在G發生。第二十一頁，共三十頁。第二十二頁，共三十頁。2.5.2.2化學修飾法測序圖解第二十三頁，共三十頁。CT+CG+AAAACAGTCCTACCGCTGAAGCAG+AT+CC試試看你作對了嗎？第二十四頁，共三十頁。2.5.2.3