酶聯免疫吸附試驗ELISA

郝丹1.ELISA的原理2.ELISA的類型3.ELISA的具體操作主要內容

ELISA是一種免疫測定，基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。1.ELISA的原理1.1抗原抗體反應1.1.1可逆性

抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡，其反應式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體的親和力,可以用平衡常數K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab

的解離程度與K值有關。

高親和力抗體的抗原結合點與抗原的決定簇在空間構型上非常適合，兩者結合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結構和活性。1.1.2特異性

抗原抗體的結合發生在抗原的決定簇與抗體的結合位點之間。化學結構和空間構型互補關系，具有高度的特異性。

測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物。

1.1.3最適比例

1.1.4敏感性化學比色法的敏感度為mg/ml水平；酶反應測定法的敏感度約為5-10μg/ml；標記的免疫敏感度可提高數千倍，達ng/ml水平；例如，HBsAg（乙型肝炎表面抗原），其敏感度可達0.1ng/ml。

ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。

可設計出各種不同類型的檢測方法。

固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗原，則結合為抗原-抗體-酶標記抗原復合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標記抗原抗體抗原固相載體2.3間接法測抗體

用于傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。酶抗抗體酶標記抗抗體抗體抗原固相載體1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗抗體，則結合為抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。2.4競爭法測抗體

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

2.5競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

2.6捕獲包被法測抗體

IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。酶抗體酶標記抗體抗原抗抗體固相載體抗體1.將抗抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗抗體-抗體復合物。3.加入抗原及酶標記抗體，則結合為抗抗體-抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。3ELISA具體操作1標本的收集和保存2試劑的準備3加樣本及反應試劑4溫育5洗板6顯色7比色8結果判斷3.1標本的收集和保存未抗凝血標本離心前一般令其自行凝集，不可用木棍等剝離凝血塊。通常于室溫（20－25℃）放置30－60min，血標本可自發完全凝集，析出血清；或37℃水浴20－30min，析出血清。以3000r/min轉速離心5－10min，使血清分離完全。若過早離心，分離不全，血清中會殘留部分纖維蛋白原，吸附于反應微孔，并且不易洗去，可與酶標記物非特異性結合，造成假陽性。

注意：（2）血清標本宜在新鮮時檢測，要注意盡量避免細菌污染。血清標本如在冰箱中保存過久，IgG可發生聚合，AFP可形成二聚體，使本底加深，產生假陽性反應。細菌生長所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；一些細菌的內源性酶可對以相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。注意:（3）冰凍保存的標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍結樣本溶解后，蛋白質局部濃縮、分布不均，應上下顛倒輕緩混勻，避免氣泡，不要在混勻器上強烈振蕩。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰凍保存。3.2試劑的準備試劑盒成分：常用的固相載體（ELISA板孔）材質：聚苯乙烯、聚氯乙烯，具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之間、同一板各孔之間性能相近。包被抗原或抗體與聚苯乙烯固相載體通過疏水基團作用物理吸附結合。常用的酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非離子型洗滌劑酶反應的底物：H2O2，為受氫體；顯色劑：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)和ABTS（一種銨鹽），為供氫體。終止液為硫酸。3.3加樣本及反應試劑在ELISA實驗中一般有3次加樣步驟，即加標本、加酶結合物、加底物和顯色劑。加樣必須注意的關鍵點是：（1）加樣不可太快，避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。如有氣泡，抗原抗體不能有效結合，導致弱陽性甚至假陰性。（2）每次加標本應更換吸頭，以免發生交叉污染。若需稀釋血清，應保證稀釋液與血清混合均勻。（3）加酶結合物、加底物，加液量應準確均一、加液過程迅速。可用試劑盒提供的滴瓶直接滴加。滴加時，除要注意滴加的角度垂直一致外，滴加速度也很重要。太快，易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象。3.4溫育溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA屬于固相免疫測定，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異性抗體或抗原完全結合，必須在一定溫度條件下反應一定的時間。一般溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，所需時間相對較短。最為常用的溫度有37℃和室溫(20－25℃)，其次是43℃和2－8℃，目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間通常為37℃

30－60分鐘。

關于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：（1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能比較長，而在臨床實驗中，很少有人注意這個問題，通常將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成在實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。為保證37℃下足夠的溫育時間，實驗室水浴狀態應保證微孔板底貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應貼片或封蓋。（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間最為完全，產物最穩定。如2－8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由于分子運動的加快，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，如須選擇反應條件，建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫度較長反應時間的條件。（3）“邊緣效應”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫置于37℃溫箱(非水浴)，板孔升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此反應板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。而將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，可使溫度迅速平衡。讓反應板飄浮在水面上。就可以很容易地排除“邊緣效應”，并且可提高測定的重復性。3.5洗板洗滌在ELISA不是反應步驟，但也決定著實驗的成敗。ELISA是靠洗滌清除殘留在板孔中沒能與固相抗體/原結合的物質，以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質，以保證ELISA測定的特異性。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。實驗室中，洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。為保證微孔板的均一性使結果準確可靠，最好選用洗板機洗板。若手工洗板，要注意浸泡時間和孔間洗液最好不要互相流動。流水沖洗法讓水流沖擊板孔表面，簡便、快速，洗滌效果較好。

3.6顯色在以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中，一般顯色反應條件為37℃或室溫反應15－30分鐘。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。TMB(四甲基聯苯胺)經HRP作用后，約40分鐘顯色達頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時后可完全消退至無色。TMB的終止液有多種，酸性終止液（硫酸）會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。底物A（含過氧化氫）底物B（含四甲基聯苯胺）終止液（含硫酸）雖然成分相同，但說明書上未提供其具體成分含量比例，所以不可以通用。3.7比色

ELISA的比色測定由酶標儀進行。強調以下幾點：（1）酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，室溫宜在15－30℃，使用前先預熱儀器15－30分鐘，測讀結果更穩定。各種酶標儀性能不同，使用前應詳細閱讀說明書。（2）比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入比色架中，以免銹蝕酶標儀比色架。（3）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。（4）單波長或雙波長比色選擇的問題。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長；雙波長比色則在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，最后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非敏感波長下的吸光度值的差值。因此，雙波長比色測定具有能排除由微孔板本身、板孔內標本的非特異性吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色干擾的優點。3.8結果判斷臨床ELISA測定按其表示測定結果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結論，分別用“陽性”和“陰性”來表示；定量測定，每批測試均須用一系列不同濃度的標準品在相同的條件下制作標準曲線。一、加樣槍的使用1.

樣品準備（1）吸樣之前要保證移液槍、槍頭和液體處于相同溫度。置于冰箱保存的樣品應提前取出，室溫放置，使溫度平衡后再吸樣。液體溫度>吸頭溫度的移取的液體體積會偏大液體溫度<吸頭溫度的移取的液體體積會偏小（2）

若溶劑瓶中液體太少，可倒入EP管中，方便吸取。

2.體積設定大體積小體積逆時針精度最佳小體積大體積順時針調至超過設定刻度，再回調

可保證最佳的精確度嚴格的精確調節方法3.

裝槍頭

將移液槍端垂直插入吸頭，左右微微轉動，上緊即可上下敲擊會引起內部的零部件因瞬間強烈撞擊而松散，甚至會導致調節刻度的旋鈕卡住4.

吸液（1）

垂直吸液，槍頭吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）

槍頭吸嘴預潤濕（2-3次），使吸嘴內壁液體吸附達到飽和，再吸入樣液，最后打出液體的體積會很精確。一般液體，正向吸液（一檔二檔）。粘稠液體和易揮發液體，可反相吸液（二檔一檔）。正向吸液反向吸液（3）

緩慢吸取，控制好彈簧的伸縮速度。吸液速度太快會產生反沖和氣泡，導致移液體積不準確和腐蝕槍體。（4）

吸取后將移液槍提離液面，停約一秒鐘，觀察是否有液滴緩慢地流出。若有流出，說明有漏氣現象（原因有：槍頭未上緊；槍頭不匹配；移液槍內部氣密性不好）。（5）吸嘴外壁殘留液滴可沿壁靠去或用濾紙蘸擦。5.

放液（1）

將吸嘴口貼到容器內壁并保持10-40°傾斜。（2）

平穩地把按鈕壓到一檔，停約一秒鐘二檔，排出剩余液體。排放致密或粘稠液體時，壓到一檔后，再多等一兩秒鐘二檔。（3）

壓住按鈕，同時提起移液器，使吸嘴貼容器壁擦過。（4）

松開按鈕。（5）

按彈射器除去移液嘴。（6）使用完畢。加樣槍的養護及注意事項吸取液體時一定要緩慢平穩地松開拇指，絕不允許突然松開，以防溶液吸入過快而沖入槍體內腐蝕柱塞造成漏氣。移液槍應輕拿輕放，不能將已吸有液體的移液槍平放或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。不得用移