生物化學與分子生物學實驗實驗課總體安排蛋白相關實驗實驗一

比色分析法及分光光度法測蛋白含量牛

抗胰蛋白酶（α1-AT）的分離及鑒定實驗二

鹽析法及凝膠過濾層析法粗提

α1-AT實驗三離子交換層析純化α1-AT及測定α1-AT活性實驗四SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定α1-AT核酸相關實驗實驗五提取小鼠肝臟DNA實驗六

DNA酶解和DN

段瓊脂糖凝膠電泳實驗七

PCR總成績試卷成績：實驗題（5分）平時成績（10分）：課堂表現(xiàn)+實驗報告書寫課堂表現(xiàn)：

紀律要求

+

做實驗的認真程度?+值日基本要求進入內(nèi)必須穿白大衣用餐，不得隨意動用實驗器材李戴”取用試劑時須“隨開隨蓋”，勿“移液器使用完畢，調(diào)回最大量程固體嚴禁傾倒至水槽實驗完畢，各小組將實驗臺上用過玻璃器皿等刷洗干凈，試劑及儀器擺放整齊，實驗臺擦干凈值日生負責整個的清潔及整理，包括實驗準備臺課堂紀律不許調(diào)成上課期間、早退、無故或靜音大聲喧嘩按時上交實驗報告冊實驗報告書寫實驗目的、原理：簡明扼要實驗步驟：簡潔，寫清楚操作的關鍵環(huán)節(jié)，可自行設計表格或流程圖表示實驗結果：如實填寫

：對實驗結果的分析，還可包括關于實驗方法、操作技術和有關實驗的問題，對實驗設計的體會與建議，對實驗課改進意見。結論：說明本次實驗所獲得結果實驗一 測定蛋白質(zhì)的含量蛋白質(zhì)含量的測定方法定氮法紫外分光光度法比色分析法雙縮脲法酚試劑法實驗目的掌握比色分析法和分光光度計法的原理。熟悉酚試劑法和雙縮脲法測蛋白濃度的實驗操作。學會標準管法和標準曲

測蛋白濃度的方法。比色分析法比色分析法：利用比較溶液顏色深淺的方法確定溶液中有色物質(zhì)的含量。比色分析法與分光光度法分光光度法（spectrophotometry）：是利用紫外光、可見光、紅外光及激光等光源測定物質(zhì)的吸收光譜，并對物質(zhì)進行定性、定量以及結構分析的技術。紫外分光光度法可見光分光光度法紅外光分光光度法（一）比色分析法的基本原理1.光的性質(zhì)可見光：波長（λ）400—760nm紫外光：λ小于400nm紅外光：λ大于760nm（一）比色分析法的基本原理1.光的性質(zhì)白光：由不同波長的光組合而成的光。單色光：單一波長的光。白光綠青青藍藍紫紅橙黃（一）比色分析法的基本原理1.光的性質(zhì)互補色光：兩種不同顏色的單色光按一定的強度比例混合，形成白光，這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。（一）比色分析法的基本原理2.溶液的顏色與光的吸收溶液呈色是溶液中的有色質(zhì)點有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。有色溶液的顏色是被吸收光顏色的互補色。白光綠青青藍藍紫紅橙黃（一）比色分析法的基本原理2.溶液的顏色與光的選擇性吸收溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深比色分析實際比的是吸光度2.溶液的顏色與光的選擇性吸收光吸收曲線：測定同一物質(zhì)吸收不同波長光線的光密度值，以波長為橫坐標，光密度為縱坐標作圖。（一）比色分析法的基本原理（一）比色分析法的基本原理未知濃度蛋白液加顯色劑顯色計算濃度測溶液吸光度值（一）比色分析法的基本原理3、-定律一束單色光通過溶液時，光被吸收的程度與溶液的濃度和液層厚度有關。濃度越大，液層越厚，則吸收光越多。比色分析法的理論依據(jù)。C3、

-

定律透光率T=I/I

=10-KCL0lg(I/I0)=lg10-KCL吸光度A

=lg(I0/I)=KCLA

=

KCL又稱光密度OD或D（一）比色分析法的基本原理C入射光強度透射光強度液層厚度C

溶液濃度（一）比色分析法的基本原理吸光系數(shù)K吸光物質(zhì)在單位濃度及單位液層厚度時的吸光度。在給定入射波長、溶液種類、溫度和PH下，吸光系數(shù)為定值。根據(jù)公式A=KCL若K與L為定值，吸光度A與溶液濃度成正比。C（二）比色分析的計算方法1、待測溶液濃度的計算方法標準管法標準曲標準系數(shù)法消光系數(shù)法（1）標準管法對已知濃度的標準液和待測液作同樣處理，使用相同的空白，同時測定吸光度A，根據(jù)測定的吸光度值A及標準品濃度C，計算待測樣品濃度。標準液：As待測液：Au=KsCsLs=

KuCuLu其中，Ls=Lu，Ks

=KuAs/Au

=Cs/CuCu

=（Au/As）×Cs（2）標準曲配制一組濃度不同的標準溶液(c1

，c2

……)在一定波長下，分別測定其吸光度(A1、A2……)以濃度c為橫坐標，A為縱坐標繪制曲線，得到一條通過原點的直線，稱為標準曲線（A-c曲線）用完全相同的方法和步驟測定待測溶液的吸光度Ax，從標準曲線上找出對應的濃度cx值A

=KCL（2）標準曲空白C2C3C4C5CXC1Cx

Ax=0.78

2.比色分析條件的選擇Folin—酚試劑法測蛋白濃度原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結合生成螯合物。此螯合物能使酚試劑中的磷鉬酸還原產(chǎn)生藍色化合物。蛋白含量計算：采用標準曲Folin—酚試劑法待測蛋白70.20.850.5實驗注意事項酚試劑加入后，迅速搖勻，即加1管搖勻1管，以免出現(xiàn)混濁雙縮脲法測蛋白濃度原理：蛋白質(zhì)含有兩個以上肽鍵，在堿性溶液中與Cu2+反應，形成紫紅色絡合物，稱為雙縮脲法。其呈色強度與蛋白質(zhì)濃度成正比。與同樣操作的已知濃度蛋白質(zhì)溶液相比較，可以求得其含量。蛋白含量計算：采用標準管法雙縮脲法管號（ml）1（B）2（S）3（U）標準—0.1—待測——0.10.9%NaCL0.1——雙縮脲試劑5.05.05.0檢測波長520nm；標準 濃度

7g%待測蛋白質(zhì)含量g%=Du/Ds*Cs分光光度計可見分光光度計紫外分光光度計紅外分光光度計全波段分光光度計光源單色器樣品室受光器測量器分光光度計從混合光中將各種單色光分離出來，并測量其波長及強度，通過分析經(jīng)溶液吸收后的透光強度來鑒定物質(zhì)的性質(zhì)和含量。（二）比色分析的條件波長的選擇光密度的選擇顯色條件的選擇（二）比色分析的條件波長的選擇光吸收曲線：測定同一物質(zhì)對不同波長光線的吸收程度，以波長為橫坐標，光密度為縱坐標作圖，所得曲線為光吸收曲線每種物質(zhì)都有獨特的光吸收曲線（二）比色分析的條件相同物質(zhì)的光吸收曲線一致同一物質(zhì)，溶液濃度不同，最大吸收波長不變吸收曲線可作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)；也是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)1

maxA2被測物、干擾物吸收光譜（1）波長的選擇吸收最大干擾最少（二）比色分析的條件（二）比色分析的條件（2）光密度的選擇0.05～1.0，光密度讀數(shù)過大或過小，讀數(shù)準確度下降。（3）顯色條件的選擇空白溶液：僅不含有被測物質(zhì)，其它溶劑、試劑和處理條件與被測溶液完全相同。意義：消除溶液中其它有色物質(zhì)的干擾、抵消比色杯和試劑對入射光的影響。722S分光光度計使用方法接通電源，打開儀器電源開關，打開樣品室蓋，預熱10min;將空白液或對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并用擦鏡紙擦凈外壁，放入樣品室內(nèi),空白液一般放于最外格，樣品比色杯放入位置與試管位置對應;調(diào)好波長;調(diào)節(jié)按鈕開蓋時，調(diào)T

參數(shù)合上蓋，調(diào)A

參數(shù)調(diào)為0調(diào)為100;逐步拉出樣品室拉桿（聽到“咔”一聲），將讀數(shù)寫入記錄本讀數(shù)完打開樣品室蓋。吸光度值(A）;分光光度計使用的注意事項1、開機先預熱至少10min，待儀器自檢穩(wěn)定后再開始測定2、樣品室蓋應輕開輕放；倒取試劑時不能在儀器表面上方操作，儀器上

放任何物品3、雙縮脲法和酚試劑法兩個實驗的測定波長分別為520n