.PAGE6.納米粒子在生物電化學傳感器中的應用賴自成先進材料與納米科技學院第一章電化學生物傳感器概述1.1電化學生物傳感器的原理與分類目前為止,生物傳感器中研究成果較多的是電化學生物傳感器。電化學生物傳感器是以生物活性物質為敏感基元,以電化學電極為信號轉換器,以電勢、電流或電容為特征檢測信號的生物傳感器。當待測物質<底物、輔酶、抗原抗體等>擴散進入固定化生物敏感層,經分子識別,發生生物化學反應,繼而被相應的化學或物理換能器轉換成可定量和處理的電信號,再經過二次儀表放大并輸出,便可得到待測物濃度。電化學生物傳感器根據分子識別元件的不同,可分為酶電極傳感器、電化學免疫傳感器、組織電極與細胞器電極傳感器、電化學DNA傳感器等;按照換能器的不同可以分為電位型、電流型、電導型和電容型等電化學生物傳感器。1.2生物組分的固定化要讓生物組分作為傳感器敏感膜使用,必須將具有分子識別能力的生物功能物質,如酶、抗原、抗體、細胞等,包藏或吸附于某種材料,形成一層敏感膜,這被稱為生物組分的固定化。因為生物組分的固定化即使決定著生物傳感器的穩定性、選擇性和靈敏度等主要性能,所有選擇合適的方法對生物組分進行固定生物傳感器的研究和開發中具有至關重要的作用,應滿足一下幾個條件首先固定后的生物識別分一子仍能夠保持很好的活性其次固定化層應有良好的穩定性與耐受性,且能適應多種測試環境最后是生物膜與轉換器必須緊密接觸,這樣有利于信號傳輸和轉換。經過近幾十年的不斷研究,已經建立了多種生物分子固定化方法,目前,被廣泛使用的固定化技術主要有吸附法、交聯法、包埋法、共價鍵合法、組合法和電化學聚合法等。吸附法是通過物理吸附對生物分子進行固定,是一種較為簡單、經濟的方法。而且可供選擇的載體類型相對較多,操作條件溫和,對生物分子活性影響較小,但生物分子與固體表面結合力較弱,容易導致固定化生物分子的泄漏或脫落,并且生物分子暴露在外,容易受到溫度、、離子強度等環境因素的影響。交聯法通常使用雙功能基團試劑,在生物分子之間、生物分子與固定材料之間交聯形成網狀結構而達到固定化的方法。最長見的交聯試劑為戊二醛,它能在溫和的條件下與蛋白的自由氨基反應,將蛋白交聯起來。采用這種方法的局限性是膜的形成條件不易確定,須仔細控制、溫度、離子強度及反應時間等。包埋法是將生物分子包埋在高分子等材料的三維空間網狀結構中,形成穩定的生物敏感膜。該技術的特點是可采用溫和的實驗條件將生物分子摻入到高分子膜中,一般不會發生化學反應,對生物分子活性影響較小膜的孔徑和形狀可控,包埋的生物分子不易發生泄漏,可固定高濃度的生物分子。不是目前使用比較多的生物分子固定化方法。共價鍵合法使生物分子通過共價鍵與固體表面結合而固定的一種方法。這種方法一般要求在低溫、低離子強度和生理條件下進行,并常加入底物以防止生物分子的活性部位與固體表面發生鍵合。當想固體如電極表面共價鍵合生物組分時,需考慮很多因素。這樣的過程通常包括三個步驟基底表面活化、生物組分的偶聯及鍵合疏松的生物分子的去除。組合法是生物組分與基底材料簡單混合以制備固定化生物膜的一種方法。這種方法制作簡單,基底表面可更新,缺點是表面不均勻、重現性差,生物組分容易泄漏,且生物分子用量大,不易微型化等。電化學聚合法使用電化學聚合法制備生物敏感膜的方法,因為要用到電化學方法,所以通常是在電極表面進行。與傳統的固定化方法相比,有以下優點簡單,電化學聚合的固定化可一步完成并直接固定在電極表面聚合膜厚度和生物分子的固定量容易被控制和調節,從而制得重現性好的生物敏感膜而且有些聚合物膜具有選擇性透過某些物質的功能,可起到降低干擾、增加選擇性的作用。1.3電化學生物傳感器的發展在電化學生物傳感器中,研究和應用最多的是酶傳感器,這種將酶作為電極結合試劑的概念是由Clark和Lyons建立的,從這開創性的工作之后,在酶電極和其它電化學生物傳感器方面均有大量的工作發表,涉及到幾何學、固定化方法、電極的構象、膜的組成等等。以酶電極為例,根據酶與電極之間電子的轉移機理,大致可將電化學生物傳感器的發展分為三代：第一代酶電極是建立在氧還原基礎上,以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖為例：隨著O2濃度減小,H2O2濃度增大,通過檢測產物H2O2濃度的變化或者氧的消耗量來測定底物濃度。該方法存在著一些明顯的缺點如溶解氧的變化可能引起電極相應的波動而且由于氧的溶解度有限,當溶解氧貧乏時,相應電流明顯下降,從而影響檢出限同時電極的響應性能受溶液的值及溫度影響很大等。為了改進第一代酶電極的缺點,便誕生了第二代酶電極即介體型酶電極。由于酶一般都是生物大分子,它們的氧化還原活性中心往往被包埋在蛋白質分子里面,而電子傳遞速率與電子給體一受體間的距離是呈指數衰減關系,導致蛋白活性中心與電極表面之間的電子傳遞速率很慢或者很難進行。因此,為了提高蛋白活性中心與電極表面之間的電子傳遞效率,人們提出利用人為加入電子媒介體來解決這一問題。第二代酶電極增加了化學修飾層。基體經過化學修飾層修飾后,可以看成是一個經改進的信號轉換器,被稱為電子轉移媒介體,電子媒介體不但可以擴大基體電極檢測化學物質的范圍,同時也降低工作電勢、提高了測定的靈敏度。電子媒介體在近十幾年中得到了迅猛的發展,其種類也越來越多,按作用機理主要分為兩大類一是含有過渡金屬元素的化合物或配合物,它們通過過渡金屬的價態變化來傳遞電子還有一種就是通過分子中的特殊官能團的結構變化來傳遞電子,這些化合物的共同特點是都含有大π鍵的環及與環相聯的雙鍵,這些雙鍵容易打開與再形成,電子的傳遞就是靠這些雙鍵的打開與再形成來實現。為更好地發揮電子媒介的作用,媒介體應有以下要求應與還原態酶迅速反應減小氧氣的競爭、具有較好的電化學性質如較低的氧化還原勢、水溶性差且對生物酶沒有毒害、化學穩定性好等。常見的媒介體主要有二茂鐵及其衍生物釕和鋨等金屬的配合物、鐵氰酸鹽、醌類、有機介體、有機染料和有機導電鹽等。但是這類方法的缺點就是加入的電子媒介體容易污染電極,影響電極的性能。第三代酶電極的生物傳感性能是通過酶在電極上的直接電化學催化來實現的,即所謂的無試劑傳感器。其機理如圖一所示。它利用酶與電極的直接電子轉移,無需加入其它試劑,這樣減少了操作步驟,是真正意義上的無試劑生物傳感器。還是以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖為例子：實現酶的直接電化學一直是生物電化學研究者努力的方向,這對于研制非媒介體的酶傳感器是非常有意義的。由于酶與電極間難以直接進行電子轉移,到目前為止,僅有氧化還原蛋白、過氧化物酶、氧化酶、氫化酶和脫氫酶、超氧化物歧化酶等少數集中分子量較小的酶,能夠在電極上直接進行有效的電子轉移。酶的直接電化學已成為生物電化學研究中最重要的發展方向之一。酶作為一類典型的生物大分子和特殊催化劑,在生命過程中扮演著極其重要的角色。理論上,酶與電極間直接電子傳遞過程更接近生物氧化還原系統的原始模型而從應用的角度出發,酶直接電化學的實現可用于發展生物燃料電池等。因此,尋找更加有效的方法和手段實現更多酶的直接電化學,以滿足生物醫學、環境監測和工業快速分析的需要,必將成為該領域的發展趨勢。電化學生物傳感器的研究二十多年來取得了迅猛的發展,取得了顯著的成績,今天電化學生物傳感器的研究和發展更加迅速和深入,主要表現在以下幾個方面實用的電化學生物傳感器與系統越來越多微型化、智能化、集成化全面進入到電化學生物傳感器研究開發隨著人類基因組研究的深入進行和微納米技術的普及與成熟,納米傳感器、基因芯片以及微全分析系統等新器件、新系統的出現,把電化學生物傳感器的研究推進到一個嶄新的發展階段。第二章納米粒子在電化學生物傳感器中應用概述進入二十一世紀,隨著納米材料與納米技術的飛速發展,納米材料在醫學成像、醫學診斷、藥物傳遞、基因治療等多個領域顯示了巨大的優勢。對于生物傳感器領域而言,納米材料在光學性能、電學性能、力學性能、磁學性能和化學活性等方面表現出的獨特性能使其成為很好的換能器元件;另一方面,生物傳感器中分子運動本身就是納米尺度范圍的,納米材料的參與可以將其優良的性能更好的整合到分子運作中,從而改進甚至革新分子運作體系。鑒于以上特點,納米材料在電化學生物傳感器中的應用引起了越來越多的科研工作者的興趣,并逐步進入到生物傳感領域,引發突破性的進展。2.1金屬納米粒子在電化學生物傳感器中應用概述金屬納米材料因其良好的電子傳遞性能成為電化學生物傳感器中最為常用的納米材料之一,如納米金、納米銀、納米鉑等,其中尤以納米金的應用最為廣泛。納米金制備簡單、化學性能穩定、具有良好的生物相容性,同時易于進行表面修飾,因此,利用納米金與生物分子構建電化學生物傳感器是非常良好的策略。20XX,Willner課題組在science上報道了納米金在電化學生物傳感器的經典應用。他們將葡萄糖氧化酶<GOD>的輔基修飾到13nm納米金球表面,然后通過雙琉基化合物將輔基修飾的納米金固定到金電極表面,最后引入脫輔基的GOD后,由于輔基與GOD的特異性結合,完整的GOD被最大限度的保持原有結構和活性,從而可以用來催化葡萄糖。再通過收集催化過程中經納米金傳遞的電化學信號,達到對葡萄糖進行定量分析和檢測的目的。此后,Willner課題組又利用納米金膠與陰離子聚合物組成的微桿得到溶液相中GOD的電化學響應,從而實現葡萄糖的高靈敏檢測。結果顯示,納米金的使用不但提高了生物酶與電極間的電子傳遞,而且微桿結構所提供的巨大比表面積使得溶液狀態下也可以獲得GOD的電化學響應。近年來,基于納米金與GOD所構建的各種葡萄糖電化學生物傳感器層出不窮,并發展出一系列的優秀的實驗方案。在納米金得到應用的同時,其它金屬納米粒子如納米鉑、納米銀也得到了廣泛的關注,利用DNA的互補配對或者凝血酶上的兩個核酸適配體結合位點,研究者將DNA修飾的納米鉑通過夾心結構修飾到電極表面,利用納米鉑催化過氧化氫底物,得到相應的催化電流。實驗證明,利用納米鉑良好的催化能力,凝血酶與核酸的檢測限分別可以達到1nM和10pM。2.2氧化物納米粒子在電化學生物傳感器中應用概述氧化物納米材料在電化學生物傳感器領域中主要應用于生物分子的固定,納米氧化物因其表面具有良好的親水性和生物相容性,有利于生物分子如蛋白質保持其生物構型,通常可以實現蛋白質內部活性中心與電極表面的直接電子傳遞。同時除了具備納米材料共有的一些性質外,納米氧化物還依材料的不同具備一些特殊的效應,比如Ti02的光電效應、納米Fe304的磁效應等。這些效應在電化學生物傳感器的構建中可以產生一些意想不到的效果。李根喜實驗組利用納米Ti02與Hb共修飾后,將其在紫外線照射,發現Hb的催化活性大大提高,電化學檢測H202的靈敏度提高了三倍,檢測限降低了兩個數量級。這一方面是由于Ti02納米粒子對紫外線的屏蔽保護了蛋白質,另一方面,Ti02在紫外線激發下產生的活性物質促進了Hb的催化活性;他們實驗室在后續的研究中發現Zn0也具有類似的效用。圖2-1二氧化鈦納米粒子與血紅蛋白共修飾電極示意圖2.3碳基納米材料在電化學生物傳感器中應用概述與金屬納米材料類似,碳基納米材料也同樣具備極好的電子傳遞能力、生物分子的高負載能力以及良好的生物相容性,同時,由于該類型納米材料本身的基礎是碳,因此其功能化將非常方便和多樣。對碳基納米材料物理化學性質的不斷深入了解,以及對其功能的不斷拓展,為其在生物傳感器的構建打下了堅實的基礎。目前,幾種常見的碳基納米材料,如碳納米管、石墨烯、富勒烯、碳納米球、碳納米纖維等,已被廣泛的應用到電化學生物傳感器的研究當中。石墨烯<Graphene>,是一種由單層sp2雜化碳原子構成的六元環蜂窩狀二維材料,厚度僅為0。335nm,自20XX誕生之日起,石墨烯便以其獨特的結構和優異的性能轟動整個科學界,掀起了人們對石墨烯經久不息的研究熱潮。在石墨烯的二維平面上,每個碳原子與相鄰的三個碳原子以σ鍵相,鍵長約為0。142nm,這些碳-碳σ鍵的形成使石墨烯具有良好的結構剛,每個碳原子還剩下一個P軌道垂直于石墨烯平面,這些相鄰的P互交蓋重疊形成離域大π鍵,π電子可以在石墨烯平面內自由移動,這種穩定的剛性晶格結構賦予了石墨烯優異的導電性能。石墨烯是形成其它維數碳材料的基本結構單元,它可以折曲形成零維的富勒烯,或卷曲形成一維的碳納米管,也可以堆疊形成三維的石墨,因此被譽為"碳材料之母"。石墨烯具有獨特的力學、光學、熱學和電學性能,在場效應晶體管、光伏電池、超級電容器、石墨烯/聚合物納米復合材料、氣體與生物傳感、藥物傳輸、燃料電池、儲氫等領域有著廣泛的應用前景。石墨烯由于具有高的導電性以及大的比表面積,修飾在電極表面后,可以在很大程度上提高其它分子在電極表面的吸附量,因此石墨烯是一種性能優異的修飾電極的理想材料,被廣泛用于電化學傳感器中以檢測各種氣體分子、有機小分子、生物大分子等。在透射電鏡下石墨烯呈現透明的,有小褶皺的薄片狀。圖2-1石墨烯透射電鏡圖目前石墨烯的功能化主要分為共價法和非共價法兩大類。盡管完美的石墨烯化學性質穩定,但實際制備的石墨烯的邊緣及缺陷部位仍具有較高的活性,尤其是通過化學法制備的石墨烯,其表面及邊緣含有大量的梭基、撥基、輕基、環氧基等,為石墨烯的進一步共價改性提供了活性位點。根據石墨烯表面的活性基團,目前石墨烯的共價功能化主要分為羧基功能化、環氧基功能化以及碳骨架功能化三大類。此外,也可以將功能化與還原結合進行,二者既可同步進行,也可在表面活性劑存在下先還原后功能化等,以達到既提高石墨烯的導電性又實現功能化的雙重目的。石墨烯的非共價功能化主要是通過π-π作用、離子鍵、氫鍵等超分子作用對石墨烯進行功能化,以提高其溶解性或分散性,并賦予石墨烯新的性能。此外,通過簡單的物理吸附也可將一些金屬納米粒子<如Au,Ag,Fe,Pd,Pt等>吸附到石墨烯表面,從而得到一些具有特殊性能和用途的金屬納米粒子功能化的石墨烯納米材料。相比較而言,共價法由于發生了化學鍵的改變會部分破壞石墨烯的本征結構而改變其本征性能;而非共價功能化的方法操作簡單,條件溫和,一般不會破壞石墨烯的本征結構和性能,但是相互作用力比較弱。因此具體的功能化應結合具體的用途,在保持石墨烯特殊結構和優良險能的基礎上尋求新的突破。景雁鳳等構建了一種基于石墨烯-Zn0<GR-ZnO>復合物的乙酰膽堿酯酶生物傳感器,并用于快速靈敏的檢測辛硫磷農藥。不同電極在5.0mmol/LK3Fe<CN>6<含有0.1mol/LKCl>溶液中的循環伏安曲線如圖2-2所示。與裸玻碳電極<曲線a>相比,