禽流感病毒檢測技術研究進展［關鍵詞］禽流感病毒；檢測技術；禽流行性感冒病毒簡稱禽流感病毒(AIV)，屬于正粘病毒科、流感病毒屬。流感病毒根據可溶性抗原不同可分為A、B、３型，只有A型(AIV)易變異［1］，并可在禽、人、豬、馬和海洋哺乳動物中爆發流行，出現輕度呼吸疾病到嚴重敗血癥等。1878年AIV在意大利首次爆發，其后在英、法、德等歐洲國家和美國均有流行。高致病性AIVH5N1于1997年在香港致6人死亡，2022～2022年在亞洲致4人死亡，2022年H7N7在荷蘭致１人死亡［2］。AIV給人類安康已帶來嚴重威脅，引起全球的極大關注，AIV檢測技術也隨之成為人們研究的熱點。現就近年來AIV檢測技術研究進展作一綜述。1病原學檢測雞胚別離培養是檢測病禽組織中AIV的一種經典、準確、敏感的病原學診斷方法，可以作為金標準，特異性和敏感度均可以到達100%［2］。2血清學檢測21病毒中和試驗〔NT〕作為經典方法，病毒中和實驗操作繁瑣、耗時、費料，臨床幾乎不用。22血凝〔HA〕和血凝抑制〔HI〕試驗AIV可以與雞紅細胞發生凝集現象，這種紅細胞凝集現象又可被特異性免疫血清所抑制，即紅細胞凝集抑制試驗。血凝和血凝抑制試驗可以鑒定病毒、檢測血清中的抗體程度。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制試驗來確定HA亞型。23神經氨酸酶抑制〔NI〕試驗微量神經氨酸酶〔NA〕抑制劑抑制NA的活性，并以半抑制濃度I50鑒定NA亞型。Hurt等［3］用5g的抗病毒藥物zanaivir建立的熒光NI試驗，檢測陽性樣本H1N1、H1N2，符合率分別為N1955%，N2897%，平均935%〔187/200〕。該方法本錢低，適于大規模地應用。24瓊脂凝膠擴散試驗〔AGP〕用于檢測AIV共同抗原核蛋白或基質蛋白。由于所有的AIV都具有型特異性共同抗原，用一種AIV的抗原或抗血清就可對所有AIV的抗體或抗原進展鑒定。免疫雙向擴散及免疫電泳中以沉淀線斷定可以定性，免疫單輻射擴散試驗可以定量。25免疫熒光技術(IFT)將抗原或抗體標記上熒光素，再進展抗原抗體反響。最早用于流感病毒是鑒定和定位病毒感染細胞中特異性的抗原、核蛋白(NP)或基質蛋白(P)抗原。用NP抗原的熒光抗體染色，主要出現核內熒光；用P抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也可出現局部熒光。26酶聯免疫吸附試驗(ELISA)運用ELISA原理建立的AIV檢測方法較多，如用單克隆抗體介導的、經生物素一親和素系統放大的H5亞型禽流感病毒捕獲ELISA檢測方法，為進一步研究檢測試劑盒提供根底［4］。AIV抗體膠體金檢測試紙條那么是膠體金免疫層析分析法，用純化病毒與膠體金顆粒偶聯，吸附在玻璃纖維上制作而成，不需要其他試劑,一步完成,反響時間只需要幾分鐘(5～10in)，是一種檢測微量AIV抗體快速、簡便的方法［5］。鄭其升等［6］用基因工程重組HA蛋白作為抗原建立了檢測AIV抗體的間接ELISA方法，可以檢測H3、H5、H7、H9亞型血清，特異性高，與傳統HI方法比擬，符合率為971%〔774/807〕。基于重組HA蛋白的間接ELISA方法可望用于AIV的保護性抗體程度檢測。3單鏈構型多態性(SSP)作為檢測基因變異的手段已得到廣泛應用，其原理是單個核苷酸的置換引起DNA單鏈構象改變,在非變性電泳中足以導致泳動率變化。Quint等［7］用高通量SSP與限制性片段長度多性〔RFLP〕分析法對照，檢測了近50株流感病毒的400多個基因片段，符合率為98%。4核酸擴增方法41RTPR基于P、NP基因的高度保守區的引物，RTPR可以鑒定AIV［810］。Lee等［9］在此根底上針對H1～H15又分別設計了15對HA基因的特異性引物，同時進展15管RTPR，可以檢測H1H15的HA亞型，該法所測80株病毒樣品，與血清學方法符合率為100%。但單管單測，操作繁瑣。Phipps等［11］建立了相對簡便的RTPR的AIV檢測法，僅用一對引物擴增出H1～H15的HA2基因，產物由雙脫氧核酸鏈中止法測序分析，盲測12株標準病毒和30株樣品病毒，并與HI對照，完全相符。為進步擴增的靈敏度和特異性，也可采用巢式或半巢式RTPR［8］。42多重RTPR(RTPR)RTRR是在RTPR根底之上實現單管多檢的相對快速和經濟的檢測方法。alik等［12］建立的RTPR方法，檢測3種不同的鳥類呼吸道病毒，與單管單檢RTPR方法結果完全相符。Yaada等［13］建立了包括5對引物的RTPR體系，可鑒別5種亞型AIV。BellauPujl等［14］運用多重半巢式RTPR可以檢測包括AIV的12種呼吸道RNA病毒，使檢測范圍進一步擴展，其203個樣本與培養方法及直接免疫熒光法對照，綜合敏感度為98%。43RealtieRTPR(RRTPR)運用特異性的熒光水解探針的RRTPR方法可使檢測時間縮短為4h［10，15］。Lee等［10］建立的檢測H5、H7亞型AIV的RRTPR方法，與傳統的培養方法比擬，并以EiD50〔50%雞胚致病指數〕為評價指標，呈正相關〔r=0972〕，T檢驗無顯著差異〔P021〕。其重復性試驗呈正相關〔r=0902〕，靈敏度H5為1fg或10２RNA拷貝，H7為10-1fg或10RNA拷貝，所測病毒濃度均低于1010EID50，該靈敏度高于培養方法。44依賴核酸序列的擴增〔NASBA〕NASBA是一種快速、等溫的RNA擴增技術，整個反響有賴于AV逆轉錄酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNaseH)共同協作而完成，不需特殊儀器，不需溫度循環，是以轉錄為根底，單鏈核苷酸的連續擴增，其反響產物是單鏈RNA。擴增產物與磁珠上的捕捉探針及釕標記的電化學發光寡核苷酸探針雜交后，形成復合物，經NuliSens閱讀器直接檢測電化學發光強度［1617］。llins等［16］檢測了亞歐地區H5亞型AIV，同時還鑒別出高致病及低致病H5亞型。Lau等［17］建立的NASBA技術可以檢測H1～H15亞型的AIV，并能區分出H5及H7亞型，整個過程從核酸別離、擴增、檢測在6h以內，靈敏度與雞胚培養相當。45環介導的等溫擴增〔lpediatedistheralaplifiatin,LAP〕Pn等［18］介紹了一種新的更加簡便的擴增方法，即環介導的等溫擴增,特異性地針對6個獨立的結合位點設計兩對引物擴增，以看家基因或外源性RNA分子作為陽性對照。由于反響中產生大量焦磷酸鎂，可以肉眼判斷結果，無需凝膠電泳。作者用該方法檢測了SARS病毒后，又檢測了H1～H3的AIV，與常規方法比擬符合率為100%。5基因芯片將RTPR獲得的DNA固化于芯片，利用核酸探針技術構建的檢測流感病毒A、B及其亞型的芯片平臺，y3、y5標記的核酸探針與靶DNA雜交，可以進一步鑒別混合體系中擴增產物。Li等［19］用DNA芯片及RTPR對流感病毒進展檢測及分型，結果顯示DNA芯片為基于PR的診斷技術提供了補充，因為基于PR的方法，直接從DNA擴增片段大小缺乏以證明是目的產物。王秀榮等［20］根據蛋白進展基因型別鑒定和HA基因亞型鑒定，用y5熒光標記，在基因芯片平臺上構建檢測H5、H7、H9亞型禽流感病毒(AIV)的實驗技術模型，檢測AIV的DNA，雜交到達預期結果。Kessler等［21］考慮到三維芯片潛在的優勢〔因其增加了幾何面積，使反響效率進步，同時動態的流質也使雜交時間縮短〕，將芯片技術進一步改良，建立了檢測流感病毒A、B的三維芯片平臺，通過比擬實驗，選擇了特異性強的隨機RTPR擴增方法，和低背景的化學發光檢測方法，檢測了AIV〔H1N1、H1N2、H3N2、H5N1〕和流感病毒B，特異性好，全部檢測過程不超過5h。6展望病毒別離培養和血凝抑制試驗經常作為評價新的檢測AIV方法的對照，但病毒別離培養耗時長，至少需7d，不利于快速診斷，病毒別離的實驗條件要求較高，同時有高致病性的危險，對毒株的檢測及管理上要嚴格考慮生物平安措施。AIV在雞胚培養過程中還可能發生發生變異［22］。血凝及血凝抑制試驗特異性好，但其操作相對繁瑣，同時必須具備一定血凝效價的標準病毒和新穎制備的紅細胞。血清學檢查對最后確診有回憶性診斷價值，一般只能在發病23周甚至更長時間才能有抗體陽性出現［17］。由于AIV血清型眾多，新的變異株不斷出現，制備血清型特異性單克隆抗體相對困難，且在各種免疫接種的情況下，血凝抑制試驗等血清學診斷方法也會失去作用。核酸擴增技術〔NAT〕檢測AIV，選擇好靶基因和引物及優化反響參數，均可獲得高靈敏度和特異性［23］。對于血清型眾多的AIV，不同亞型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特異地分型在AIV診斷中顯得尤為重要，而當前的核酸擴增技術尚不能高通量地鑒別出所有HA或NA的亞型。RTPR方法可以獲得所有AIV的HA亞型，但最終結果尚需借助測序方法［10］，不能作為常規檢測手段。要實現高通量、大規模的檢測，有望借助生物芯片這項技術。生物芯片正逐步應用于細菌及病毒的檢測，它不僅能克制PR擴增技術中難題，對PR擴增技術還能起到補充作用［19］。目前人們針對病毒，甚至AIV檢測芯片不斷優化雜交條件；將核酸擴增產物片段化，以減少核酸二、三級構造效應對雜交的影響；以及對芯片載體構造和檢測方法進展改良，都為建立快速、靈敏、特異的AIV檢測方法提供平臺［21］。［參考文獻］［1］ZABNThepathgenesisfinfluenzainhuans［J］.RevedVirl，2001，11:227241［2］STNEB,BURRSJ,SHEPETIUKS,etalRapiddetetinandsiultaneussubtypedifferentiatinfinfluenzaAvirusesbyrealtiePR［J］.JVirlethds，2022，117：103112［3］HURTA,BARRIG,KADINAN,etalAnveleansfidentifyingtheneurainidasetypefurrentlyirulatinghuanA(H1)influenzaviruses［J］.VirusRes，2022，103：7983［4］王傳彬，田新生，曹振，等H5亞型禽流感病毒單抗一生物素捕獲ELISA的建立［J］.中國實驗動物學報，2022，l2〔4〕：204207［5］林志雄,田純見,朱道中,等.GIA檢測高致病性禽流感抗體方法的建立［J］.2022,15(2)：1214［6］鄭其升，劉華雷，張曉勇，等H9N2亞型AIVHA基因的原核表達及間接ELISA方法的建立［J］.中國病毒學，2022，20(3)：293297［7］QUINTJD,ANGK.Ahighthrughputsinglestrandednfratinplyrphisassayfrdetetin,subtypingandgentypingfinfluenzaviruses［J］.InternatinalngressSeries，2022，1263：653657［8］STARIKE,RERBERDRFERA，ERNERTypeandsubtypespeifiRTPRassaysfravianinfluenzaAviruses(AIV)［J］.JVetedInfetDisVetPubliHealth,2000，47〔4〕：295301［9］LEES,HANGP,SHIENJH,etalIdentifiatinandsubtypingfavianinfluenzavirusesbyreversetransriptinPR［J］.JVirlethds，2001，97：1322［10］LEE,SUAREZDLAppliatinfrealtieRTPRfrthequantitatinandpetitiverepliatinstudyfH5andH7subtypeavianinfluenzavirus［J］.JVirlethds，2022，119：151158［11］PHIPPSLP,ESSENS,BRNIHGenetisub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