分子生物學實驗思考題答案分子生物學實驗思考題答案分子生物學實驗思考題答案V:1.0精細整理，僅供參考分子生物學實驗思考題答案日期：20xx年X月分子生物學實驗思考題答案實驗一、基因組DNA的提取為什么構建DNA文庫時，一定要用大分子DNA?答、文庫的大小(即數目)取決于基因組的大小和片段的大小，片段大則文庫數目小一些也可以包含99%甚至以上的基因組。而文庫數目小則方便研究人員操作和文庫的保存。所以構建文庫要用攜帶能力大的載體克隆盡量大的DNA片段.2、如何檢測和保證DNA的質量？答、用凝膠電泳看，有沒有質白質和RNA等物質的污染，還可以測OD，用OD260/280來判斷，當OD260/OD280<1.8，表示蛋白質含量較高當OD260/OD280>2.0，表示RNA含量較高當OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA較純。實驗二、植物總RNA的提取RNA酶的變性和失活劑有哪些其中在總RNA的抽提中主要可用哪幾種

答、有DEPC,Trizol，氧釩核糖核苷復合物，RNA酶的蛋白抑制劑以及SDS，尿素，硅藻土等；在總RNA提取中用PEPC,Trizol怎樣從總RNA中進行mRNA的分離和純化。答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特點合成一段oligo(dT)的引物，根據堿基互補配對原則，可將mRNA從總RNA中分離出來實驗四、大腸桿菌感受態細胞的制備感受態細胞制備過程中應該注意什么？答、A）細菌的生長狀態：不要用經過多次轉接或儲于4℃的培養菌，最好從-80℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，可通過監測培養液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時，細胞密度在5×107個/mL左右，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。B）所有操作均應在無菌條件和冰上進行；實驗操作時要格外小心，懸浮細胞時要輕柔，以免造成菌體破裂，影響轉化。C）經CaCl2處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24小時達到最高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的）；D）化合物及無機離子的影響：在Ca2+的基礎上聯合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（100-1000倍）；E）所使用的器皿必須干凈。少量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；感受態細胞制備可用在哪些研究和應用領域？答、在基因工程中將質粒導入受體細胞是如果受體細胞是細菌則將它用Ca2+處理變為感受態細胞質粒進入。實驗五、質粒在大腸桿菌中的轉化和鑒定在熱激以后進行活化培養，這時的培養基中為什么不加入抗生素？答、活化培養用的一般是SOC培養基，這種培養基比LB培養基營養，此時進行的活化培養只是為了讓大腸桿菌迅速復蘇，恢復分裂活性，此時的細胞還不具抗性，加入抗生素會細胞會死亡。什么是質粒根據在細菌中的復制，質粒有幾種類型用于基因重組的主要用到哪些質粒答、質粒是細菌體內的環狀DNA分子。

質粒也是作為細菌遺傳載體的一部分，但通常其攜帶的基因對細菌而言必要性要比核內DNA的小很多。比如，抗性基因，熒光蛋白基因等等。

根據質粒隨細胞分裂而分裂的次數，將其分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有1～2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒。

常用于基因重組的質粒是pBR322質粒，因為其基因測序已經完成，而且它攜帶了兩個標記基因，一個是氨芐青霉素抗性基因Apr，另一個是四環素抗性基因Tetr。實驗六、質粒DNA的分離純化和鑒定1、在實驗過程中，加入的EDTA、SDS分別起什么作用?答、EDTA可以結合DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解細菌和沉淀蛋白。乙酸鉀在實驗過程中主要起什么作用?答、主要是在分離過程中起著中和PH的作用，DNA經堿（NaoH)裂解后，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋解開，質粒DNA氫鍵斷裂，互補鏈不能完全分離，再經乙酸鉀中和成中性后則復性離心就可以達到分離的效果。氯仿在核酸的提取過程中有何作用？答、克服酚的特點，加速有機層和液相的分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中跡量酚。本實驗整個過程中應該注意些什么？答、1、提取過程應盡量保持低溫；2、提取質粒DNA過程中除去蛋白質很重要，采用酚、氯仿去除蛋白質要比單獨用酚或者氯仿要好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。3、沉淀DNA一般使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可以使沉淀完全。沉淀DNA也可以使用異丙醇（一般使用等體積),且沉淀完全，速度快，但常把鹽沉淀，所以多數還是用乙醇。實驗七、聚合酶鏈式反應——一般原理和技術降低退火溫度對反應有何影響？答、變性所需的加熱溫度取決于模板及PCR產物雙鏈DNA中的G+C含量。雙鏈DNA中的G+C的比率越高，則雙鏈DNA分離變性的溫度也就越高。變性所需的時間與DNA分子的長度相關，DNA分子越長，在特定的變性溫度下使雙鏈DNA分子完全分離所需的時間就越長。若變性溫度太低或變性時間太短，則只能使DNA模板中富含AT的區域產生變性，當PCR循環中的反應溫度降低時，部分變性的DNA模板又重新結合成雙鏈DNA，從而導致PCR的失敗。非特異性條帶數增多。PCR循環次數是否越多越好？為何答、循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。PCR技術可應用與哪些方面？舉例。答、1、核酸的基礎研究：基因組克隆不對稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測序3、反向PCR測定未知DNA區域4、反轉錄PCR（RT-PCR）用于檢測細胞中基因表達水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCR用于對PCR產物實時監控6、cDNA末端快速擴增技術7、檢測基因的表達8、醫學應用：檢測細菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾病；診斷腫瘤；應用于法醫物證學實驗八、DNA的限制性內切酶酶切和鑒定1、寫出ECORI和Hind3兩種內切酶消化產物的末端序列。答、G^AATTCEcoRI的識別序列和切割位點，粘性末端即：AATTC-CTTAA^GG-HindⅢ的識別序列為：A^AGCTT“^”為切割位點，黏性末端為：AGCTT-A-什么是粘性末端和平末端？答、用限制酶切割后得到的末端齊平就是平末端，一長一短就是粘性末端3、限制性內切酶在基因工程中有什么作用？答、用同種限制酶對含目的基因的DNA分子和運載體（如：HYPERLINK"/