2012.09第二節噬噬菌體載載體2噬菌體載體體（phagevectors）一、噬菌體載載體二、單鏈噬噬菌體載體體三、噬菌粒粒載體四、柯斯質質粒載體一、噬菌體載載體噬菌體是一一類細菌病病毒（Bacteriophage）（一）噬菌菌體的一般般特性結構：蛋白質外殼殼內包裹著著DNA（雙鏈、單單鏈、線性性、環狀等等）。T4Bacteriophage71.噬菌體的生生物學特性性溶菌周期指指噬菌體將將DNA注注入寄主細細胞后很快快環化，然然后進行自自我復制、、蛋白衣殼殼合成和新新噬菌體顆顆粒的組裝裝，最后使使寄主細胞胞破裂而釋釋放出大量量的子代噬噬菌體。溶源周期中中，注入寄寄主細胞的的噬菌體DNA是整整合到寄主主細胞染色色體上并可可以隨著寄寄主細胞的的分裂而進進行復制。。整合了一套套完整的噬噬菌體基因因組的細菌菌被稱為溶溶源性細菌菌。在溶源源性細菌內內存在的整整合或非整整合的噬菌菌體DNA被稱為原原噬菌體。。噬菌體溫和噬菌體體，具有溶溶源生長周周期和溶菌菌生長周期期烈性噬菌體體,只具有溶菌菌生長周期期分為兩種：：（1）溶溶菌周期：：噬菌體的生生活周期烈性噬菌體體（virulentphage)（2）溶溶原周期：：感染細菌后后，將自己己的DNA整合到細細菌的染色色體DNA中。形成成這一過程程稱為溶源源化溫和噬菌體體（temperatephage)2、噬菌體的結結構和其核核酸類型：結構：無尾部結構構的二十面面體型、具尾部結構構的二十面面體型、線狀體型核酸類型：：最常見的的是雙鏈線線性DNA、雙鏈環形DNA、單鏈環形DNA、單鏈線形DNA、單鏈RNA。3、λ-DNA的物物理圖譜λ-DNA為線狀雙雙鏈DNA分子，兩兩端各有一一個12核核苷酸的互互補單鏈（（粘性末端端）GGGCGGCGACCT,CCCGCCGCTGGA，稱為cos區，，全長48.5kb。特點點是是功功能能相相近近的的基基因因在在基基因因組組中中聚聚集集在在一一起起。。λ噬噬菌菌體體組成成特特點點：雙鏈鏈線線狀狀DNA分分子子，，全長長50kb，，含65個個基基因因，，在其其分分子子兩兩端端各各含含有有12個個堿堿基基的的互互補補單單鏈鏈，，是是天天然然的的粘粘性性末末端端，，被被稱稱為為COS位位點點。。λ噬菌體體感染細細菌后的的溶菌性性生長和和溶源性性生長溶菌性生生長（lyticpathway）噬菌體感感染細菌菌后，借借助其2個COS位點點互補成成環，在在宿主菌菌體內連連續復制制，合成成大量基基因產物物，進而而裝配成成噬菌體體顆粒，，裂解宿宿主菌，，釋放出出來的噬噬菌體又又可感染染其他細細菌。溶源性生生長(lysogenicpathway)噬菌體感感染細菌菌后，可可將自身身DNA整合到到細菌的的染色體體中去，，與之一一起復制制，并遺遺傳給子子代細胞胞，宿主主細胞不不被裂解解。噬菌體AWBDEFZJattxisNclcroOPQSR結構區重組區調控區裂解區cos位位點cos位點ARAREcoRI目的基因因EcoRIEcoRI插入型置換型AWBCDEFZUVGHMLKIJb2cIcrocIIOPQSRattintxisgamredcIIINCOSCOS頭部基因因尾尾部基因因功功能不不明區溶源化重重組早早期期控制阻阻遏遏DNA合成溶溶菌生長非必必須區段段cI基因因：溶源源過程控控制基因因。λ噬菌體體的基因因組結構構5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’’CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)GGGCGGGCGACCTCG-3’5’-CG+GC-5’’3’-GCCCCGCCGCTGGAThephagecosendsCircularformLinearform（二）λλ噬菌體體載體的的主要類類型（1）插入式載載體一種只具具有一個個可供外外源DNA插入入的克隆隆位點的的派派生載載體。（2）替替換型型載體（（取代型型載體））具有成對對的克隆隆位點，，在這兩兩個位位點之間間的λDNA區段可可以被外外源插入入的DNA片段段所取代代。（3）凱凱倫倫噬菌體體載體（2）λλ替換換型載體體（取代代型載體體）外源DNA取代代噬菌體體染色體體中對于于噬菌體體的感染染和復制制非必要要的片段段(~20kb)高感染效效率(109轉化株/ug載載體DNA,比比質粒高高100-倍)e.g.EMBL3,DASH替換式載載體野生型噬噬菌體染染色體的的中段對對于噬菌菌體的感感染和復復制是非非必要的的，外源源DNA可以取取代這一一片段，，例如Charon4A、、λEMBL3/4、、Charon40等等載體，，這些載載體是用用Lac5（（乳糖操操縱子的的大部分分系列，，包括完完整的LacZ）替替換入噬噬菌體的的中間區區段，同同時將Lac5作為為選擇標標記，使使用時用用EcoRI水水解，去去掉中間間的片段段，再與與欲克隆隆片段在在體外進進行重組組、包裝裝。而后后，感染染E.coli使之在在E.coli內繁殖殖，并并裂解解E.coli，形成成空斑斑。換型噬噬菌體體λ是是使用用最廣廣泛的的載體體。（3））凱倫倫噬菌菌體載載體既有插插入型型；又又有替替換型型在基因因工程程實驗驗中的的用途途十分分廣泛泛承受外外源DNA的能能力：：幾個個kb到23kb（左右右臂連連接））（（三段段自身身連接接）（（插插入片片段））（三））體外外包裝裝λ噬菌菌體DNA體外外重組組后，，一般般必須須經過過體外外包裝裝，然然后以以噬菌菌體感感染的的方式式將重重組DNA導入入E.coli細胞內內。這這是因因為以以感染染方式式導入入細胞胞的頻頻率可可達106~108/μgDNA，，而以以轉染染（translation）的的方式式導入入的頻頻率僅僅為103~105/μμgDNA。λ噬菌菌體的的包裝裝限制制為野野生噬噬菌體體DNA（（約48.5kb）的的75%~105%。由于λ噬菌體包裝時，當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%~105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。插入式載體可攜帶的外源ＤＮＡ片段較替換式為小。

◆λλ噬菌菌體載載體可可接受受15kb-23kb的的外源源DNA片片段，，它既既可作作為克克隆載載體，，也可可作為為表達達載體體，廣廣泛用用于各各類基基因庫庫的構構建。。篩選標標記：：藍白斑(LacZ)、噬菌斑等。重組噬菌體體的分子量必必須在野生型噬菌體分子量大小小的75%至105%之間。用途：b.用于構建基基因組或cDNA文文庫。c.用于抗體庫庫或隨機肽肽庫的構建建。a.用作一般的的克隆載體體。（四）λλ-DNA的抽提大腸桿菌培培養至對數數生長期2)加入入λ-噬菌菌體或重組組λ-噬菌菌體懸浮液液，37℃℃培養1hr3)用新新鮮培養稀稀釋，繼續續培養4-12hr4)高高速速離離心心，，沉沉淀淀噬噬菌菌體體5)苯苯酚酚抽抽提提，，釋釋放放λλ-DNA6)乙乙醇醇或或異異丙丙醇醇沉沉淀淀DNA（五五））λλ-DNA作作為為載載體體的的優優點點體外外包包裝裝病病毒毒顆顆粒粒，，高高效效感感染染E.coli2)裝裝載載外外源源能能力力為為25kb，，大大于于質質粒粒3)篩篩選選方方便便4)重重組組λλ-DNA分分子子提提取取容容易易二、、單鏈鏈噬噬菌菌體體載載體體（一一））單鏈鏈噬噬菌菌體體載載體體M13、f1、fd噬菌菌體體單鏈鏈環環狀狀DNA的絲絲狀狀大大腸腸桿桿菌菌噬噬菌菌體體：：M13噬菌菌體體單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體載載體體M13、、f1、、fd。。優越越性性：：1.單單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體的的復復制制，，是是以以雙雙鏈鏈環環形形的的DNA為為媒媒介介的的，，這這種種復復制制形形式式的的DNA簡簡稱稱RFDNA；；2.不不論論是是RFDNA還還是是ssDNA都都能能感感染染大大腸腸桿桿菌菌；；3.單單鏈鏈DNA噬噬菌菌體體顆顆粒粒的的大大小小，，是是受受其其DNA的的多多制制約約的的，，不不存存在在包包裝裝限限制制問問題題；；4.容容易易測測定定外外源源DNA片片斷斷的的插插入入取取向向；；5.可可產產生生含含外外源源片片斷斷的的單單鏈鏈DNA分分子子。。3.M13噬噬菌菌體體噬菌菌體體正鏈鏈復制制復制制型型DNA經pII蛋蛋白白造缺缺口口3′′5′′經pII蛋白剪切釋出單鏈DNA(正鏈)進入下一循環5′3′3′5′滾環復制在細菌內的復復制模式圖M13噬菌體體幾個重要特特點：1.M13噬菌體不溶解宿主細胞，只只是降低宿主細胞的生生長速度。2.M13噬菌體能能以單鏈和雙鏈兩種方式存在在，因此可以以用感染(經包裝的單單鏈DNA)和轉化(雙鏈DNA)。3.克隆的的外源基因片片段不宜大于于1000bp。M13噬菌體體載體M13是一種種含單鍵（+）DNA（（ssDNA）的絲狀大大腸桿菌噬菌菌體，其基因因組大小為6.4kb。。這類載體主主要用來獲得得大量的單鏈鏈ＤＮＡ片段段，這種單鏈鏈ＤＮＡ片段段在遺傳學研研究中主要用用來測定ＤＮＮＡ序列（sanger雙脫氧法））、基因的定定點突變研究究、異源雙鏈鏈DNA的分分析等。M13噬菌體體的特點感染Ecoli后，在宿主細細胞內會形成成雙鏈的復制制型ＤＮＡ（（replicationformDNA,RFDNA））。可以象質質粒ＤＮＡ那那樣在體外進進行純化和操操作。成熟的噬菌體體顆粒僅能感感染E.coli的F+細胞，這是因因為這種噬菌菌體的感染位位點在性散毛毛上。但是無無論是RFDNA或ssDNA都能轉染E.coli的F+或F-細胞。噬菌體顆粒的的大小是受其其ＤＮＡ的大大小制約的，，這一點正好好與λ噬菌體體相反。所以以M13噬菌菌體并不存在在包裝限制的的問題。M13單鏈DNA噬菌體體的生命周期期RFDNAPhageM13replicationinthehostcell:+RNApolDNApolIII±RFNickedbygene2protein+ss-Rollingcirclereplication,thencutandligateCoatedwithgene5proteinGene5proteinisreplacedbygene8proteinect.LinearM13phagereleasedfromthecell.（二二））M13載載體體的的構構建建（1））克克隆隆區區域域的的選選定定①基基因因間間隔隔區區（（intergenicregion,IG區區））J.Messing證證明明，，IG區區存存在在M13的的復制制起起點點，但但可可以以插插入入外外源源DNA而而不不影影響響M13噬噬菌菌體體的的活活力力。。在IG區區內內插插入入一一個個大大腸腸桿桿菌菌的的LacZ’’（-肽肽序序列列)。。利用用-肽肽序序列列中中的的三三個個單單一一酶酶切切位位點點（（BglII、、AvaII和和PvuI））。。(2)加加入入酶酶切切位位點點①在在IG區區內內加加入入單單一一內內切切酶酶位位點點第一一個個M13載載體體：：M13mp1：：M13RFBsuI不完完全全消消化化各種種長長度度的的線線性性片片斷斷（其其中中應應有有只只在在IG上上切切開開的的線線性性全全長長M13））E.colilac基因因的的HindII片斷斷(lacI、lacP、lacO、lacZ’’）連接接M13mp1JM101宿主主只有有在在IG區插插入入lacZ’’才能能存存活活并并在在Xgal上出出現現互互補補的的藍藍噬噬菌菌斑斑（三三））M13系系列列載載體體的的優優點點1））有MCS，，便便于于克克隆隆不不同同的的酶酶切切片片段段2））Xgal顯顯色色反反應應，，可可供供直直接接選選擇擇3））無無包包裝裝限限制制，，克克隆隆能能力力大大4））可可以以克克隆隆雙雙鏈鏈DNA分分子子中中的的每每一一條條鏈鏈子代代M13噬噬菌菌體體中中包包含含的的是是單單鏈鏈+DNA。。（四四））M13噬噬菌菌體體用用途途：1））DNA序序列列測測定定；；2）制制備單單鏈DNA探針針；3）用用于定定點突變變的研究究。M13載載體具有多克克隆位點點(MCS)，，方便克克隆。許許多M13載體體的多克克隆位點點與質粒粒載體pUC序序列的多多克隆位位點是相相同的，，在克隆隆位點選選擇上更更為方便便。可以定向向地克隆隆DNA片段，，克隆在在M13RFDNA分子子上的雙雙鏈DNA片段段，到了了子代噬噬菌體便便成了單單鏈的形形式。所所以如果果要同時時分離ＤＤＮＡ分分子中的的雙鏈，，則需要要兩種獨獨立的克克隆。根根據M13的生生物學特特性知道道，M13子代代噬菌體體中總是是只含有有（＋））鏈，所所以M13載體體克隆的的外源DNA片片段在子子代噬菌菌體中究究竟是含含有DNA分子子中的哪哪條鏈，，則完全全取決于于外源ＤＤＮＡ克克隆時的的取向。。這樣一一來，為為分別分分離外源源ＤＮＡＡ分子的的兩條鏈鏈帶來一一定的麻麻煩，解解決這一一問題的的一個行行之有效效的方法法就是定定向克隆隆技術。。M13克克隆載體體分子結結構圖三、噬菌菌粒載體體噬菌粒載載體由質粒載載體和單單鏈噬菌菌體載體體結合而而成的新新型的載載體系列列。它具有質質粒的復復制起點點、選擇擇性標記記、多克克隆位點點等，方方便DNA的操操作，可可在細胞胞內穩定定存在；；又具有有單鏈噬噬菌體的的復制起起點，在在輔助噬噬菌體的的存在下下，可進進行噬菌菌體的繁繁殖，產產生單鏈噬菌粒載體（（phagemidvectors）由質粒載體與單鏈噬菌體載載體的復制起點結結合而成的新新型載體系列列。MCS噬菌體ori質粒oriAmprlacZ’lacI約3000bp（比M13小）②克隆能力大大能插入10kb的外源DNA。③兩種復制形形式①分子量小1、噬菌粒載載體的特點既具有質粒的的復制起點，，又具有噬菌菌體的復制起起點。既能在大腸桿桿菌中以質粒粒的形式雙鏈鏈復制，又能能在噬菌體內內進行單鏈復復制。常用的噬菌菌粒載體pUC118和p1.具有較小分子量的共價、閉合、環形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進行分離與操作；2.編碼一個ampr基因作為選擇記號，因此只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉化子細胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養基中生長，便于轉化子的選擇；3.拷貝數含量高，每個寄主可高達500個，所以只要用少量的大腸桿菌細胞培養物，便可制備出大量的載體DNA；4.存在著一個多克隆位點區，因此許多種不同類型的外源DNA片段，不經修飾便可直接插入到載體分子上；5.由于于多克隆位位點區阻斷斷了大腸桿桿菌lacZ基因的的5’-端端編碼區，，可按照IPTG組組織化學顯顯色反應試試驗，篩選選重組子；；6.lacZ基因因是置于lac啟動動子的控制制之下，這這樣插入的的外源基因因便會以融融合蛋白質質的形式表表達；7.含有質質粒的復制起8.帶有一個M13噬菌體的復制起點，在有輔助噬菌體感染的寄主細胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養基中；9.在pUC118和和pUC119這兩個載載體中，多克克隆位點區的的核苷酸序列列取向是彼此此相反的，于于是它們當中中的一個可轉轉錄克隆基因因的正鏈DNA，另一個個則可轉錄出出負鏈DNA；10.可以以直接對克隆隆的DNA片片斷進行核苷苷酸的序列測測定，免去了了從質粒載體體到噬菌體的的這一煩瑣的的亞克隆步驟驟。pBluescript噬菌粒載體體基本結構：1.在多克克隆位點的兩兩側，有一對對T3和T7噬菌體的啟啟動子，可以以定向指導外外源基因的轉轉錄活動；2.同3.編碼有一個胺芐青霉素抗性基因，供作轉化子記號；4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG組織顯色反應法篩選噬菌粒載體。T7T3用于體體外轉轉錄3PCR產物物克隆隆載體體T載載體體pCR系列列載體體Invitrogen公公司開開發的的線性性噬菌菌粒粒載載體體。。①結結構構pUC的的質質粒粒部部分分、、fi噬噬菌菌體體ori、、Kanr和Ampr抗性性。。MCS的的中中部部已已經經切切開開，，各各有有一一個個3’’端端突突出出的的T。。②特特點點PCR產產物物往往往往在在3’’端端突突出出一一個個A，，所所以以能能與與這這個個載載體體直直接接連連接接。。Tvector的克克隆隆過過程程———簡便便！！AATTTvectorPCRproductT4DNAligaseAA四、、柯柯斯斯質質粒粒載載體體柯斯斯質質粒粒(cosmid)一種種人人工工構構建建的的克克隆隆載載體體，，包包含含了了λλ噬噬菌菌體體的的cos基基因因。。柯柯斯斯質質粒粒能能被被包包裝裝到到λλ噬噬菌菌體體粒粒子子中中，，感感染染大大腸腸桿桿菌菌；；它它攜攜帶帶入入宿宿主主細細菌菌的的DNA片片段段（（超超過過45kb））要要比比質質粒粒載載體體攜攜帶帶的的要要大大（一）粘粘粒(cosmid)組成：2.抗抗性基基因；1.質質粒復復制的起起始位點點(ORI)；3.用用于插插入目的的基因的的單個酶酶切位點點；4.噬菌體的的cos位位點。可見，cosmid是由質粒粒和噬菌體的的cos位位點構建而成成。與噬菌體體載體和和質粒載載體相比比具有多多個優點點：（1）具具有cos位點點，能高高效地轉轉化大腸腸桿菌，，能在大大腸桿菌菌中實現現自身環環化，并并能在大大腸桿菌菌中復制制；（2）有有像質粒粒一樣的的選擇標標記；（3）cosmid載載體比較較小，但但能插入入較大的的外源片片段，可可克隆外外源片段段的長度度在15~45kb之間。。由于cosmid載體體的大片片段克隆隆能力，，多用于于基因組組文庫的的構建，，而λ噬噬菌體載載體多用用于cDNA文文庫的構構建。已已有多種種粘粒載載體可用用于基因因克隆，，pJB8是最最常用的的粘粒載載體之一一（4)多多種單單一酶酶切位位點，，便于于克隆隆1、粘粘粒載載體的的優點點柯斯質質粒載載體的的特點點具有λλ噬菌菌體的的特性性；具有質質粒載載體的的特性性；具有較較高容容量的的克隆隆能力力；具有與與同源源性序序列的的質粒粒進行行重組組的能能力特點：：可插入入長達達27～～41kb的外源源基因因，方方便地地用于于克隆大大片段段DNA。加入噬菌體體頭部和和尾部部蛋白白，可可將粘粒包包裝成成類似似于噬菌體體的具感感染能能力的的顆粒粒，方方便地地進入入大腸腸桿菌菌。粘粒進進入細細菌后后則完完全失失去噬菌體體的功能，而而表現質粒的特性。柯斯質粒載載體cosmid載體：也稱粘粒粒、柯斯載載體。這是是一類用于于克隆大片片段DNA的載體，，它是由λλ噬菌體的的cos（（cohesive）末端及及