1、第三章 高效液相色譜法 High Performance Liquid Chromatography12 第一節、概述一、色譜法的定義色譜法是一種分離方法。它的特點是：有兩相，一是固定相，一是流動相，兩相作相向運動。將色譜法用于分析中，則稱為色譜分析。色譜分析是一種分離、分析法。23二、色譜法分離原理當流動相中所攜帶的混合物流過固定相時，就會和固定相發生作用(力的作用)。由于混合物中各組分在性質和結構上有差異，與固定相發生作用的大小也有差異。因此在同一推動力作用下，不同組分在固定相中的滯留時間有長有短，從而按先后不同的次序從固定相中流出。34三、色譜法的分類 按流動相狀態的不同，可分為氣相色譜

2、法 (GC)以氣體為流動相的色譜法液相色譜法 (LC)以液體為流動相的色譜法超臨界流體色譜 (SFC)45氣相色譜法適合分離分析易汽化（在- 190-500范圍內有0.2-10mmHg的蒸氣壓的）穩定、不易分解、不易反應的樣品，特別適合用于同系物、同分異構體的分離。液相色譜法適合分離分析高沸點、熱不穩定、離子型的樣品。56按固定相使用的形式可液相色譜法又可分為：柱色譜（Column Chromatography） 將固定相裝在色譜柱內紙色譜（Paper Chromatography） 用濾紙做固定相或固定相載體的色譜薄層色譜（Thin Lay Chromatography） 固定相均勻涂在玻璃

3、板或塑料板上 6四、高效液相色譜（一）高效液相色譜（HPLC）含義： 高效能固體細微粒為固定相 高壓溶劑為流動相 高靈敏度檢測器78死時間(tM):完全不保留組分流出系統的時間保留時間(tR):調整保留時間(tR):死體積(VM):保留體積(VR): 調整保留體積(VR):8（二）高效液相色譜與其它色譜方法的比較1. HPLC與經典LC的比較經典LCHPLC固定相顆粒100m,不均勻固定相顆粒BC正、反相色譜中極性和保留時間的關系4344R: 分離度tR: 保留時間t0：死時間W：峰底寬度五. 色譜分離基本方程（一）分離度（R）反映的是相鄰兩個峰的分開程度4445不同R值時峰重疊情況示意圖R1

4、.5可以得到基線分離R太小，兩個峰無法徹底分離R太大，分離時間過長，工作效率低下一般要求R1.5，也可遵循行業特殊規定4546其中： n:理論塔板 ：分離選擇性因子， K:分配系數 根據該公式優化試驗條件，提高分離度R。 從數學推導來看，分別增大n，k值，都可以提高分離度。（二）色譜分離基本方程461、選擇因子在定性分析中，通常固定一個色譜峰作為標準（s），然后再求其它峰（i）對這個峰的相對保留值，此時可用符號表示，即 = tr (i) / tr (s) 式中tr (i)為后出峰的調整保留時間，所以總是大于1的。相對保留值往往可作為衡量固定相選擇性的指標，又稱選擇因子。 4748分離選擇性（）

5、對分離度（R）的影響 如果t0=1min=1.64/1.58=1.04 =1.15/0.85=1.35 =0.95/0.63=1.50 改變分離選擇性的方法 改用不同的流動相 改變流動相的組成 并非必須大于1.5！ 改變流動相pH值 盡量優化前幾種實驗條件提高a值， 改變柱溫 避免改變固定相（買新柱子），以便降低成本 應用特殊的化學效應 改變固定相48 2、分配系數K 指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間分配達平衡時的濃度之比值，即 K=溶質在固定相中的濃度 / 溶質在流動相中的濃度 = Cs / Cm 分配系數是由組分和固定相的熱力學性質決定的，它是每一個溶質的特征值，它僅與三個變

6、量有關：固定相、流動相和溫度。與兩相體積、柱管的特性以及所使用的儀器無關49503、理論塔板數和理論塔板高度的計算方法理論塔板數理論塔板高度HETP=L/n理論塔板數n越大，柱效越高；理論塔高度HETP越小，柱效越高5051柱效（n）對分離度（R）的影響以上兩張譜圖k，, 值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度。直觀的看，峰的尖銳程度代表了柱效高低，峰越尖銳，其柱效越高，通常使用理論塔板數（n）的大小衡量柱效的高低51524、容量因子（k）對分離度（R）的影響容量因子越大，分離度越大。 k 1 3 5 7 9 11 13 k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0

7、.90 0.92 0.93 1.00但當容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時間將大大延長。因此，k的最佳范圍是1k電泳時,陰離子在負極最后流出722、毛細管凝膠電泳 CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質、DNA等采用CGE能獲得良好分離，DNA排序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。73 （1）緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達到臨界濃度，形成一疏水內核、外部帶負電的膠束。3、 膠束電動毛細管色譜（MECC ，MEKC） 在電場力的作

8、用下，膠束在柱中移動。 （2）電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動；74 （5）色譜與電泳分離模式的結合。 （3）中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結合的較牢，流出時間長； （4）可用來分離中性物質，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；75加電滲流改性劑使電滲流反向，用于淌度很大的離子的分離，主要是無機陰離子的分離。負高壓 。加陽離子表面活性劑，如十六烷基三甲基溴化銨電滲流XXXXX（）高壓（）地4、 毛細管離子分析76三、高效毛細管電泳儀器清洗記錄檢測器高壓電源毛細管電解液771、高壓電源：產生030kV 穩定連續可調電壓2、進樣系統進樣量：毛細管長度的1%-2%；納升級、非常小；進樣端加壓、出口端抽真空、虹吸進樣4、檢測系統商品儀器：UV-VIS；熒光 實驗室：質譜，電分析5、清洗系統一般用負壓法，NaOH洗液，減少吸附3、毛細管柱：毛細管分離柱不涂敷任何固定液78四、應用及前景