1、Rainbow beads演示質控（QC）和Diva軟件操作練習儀器質量控制（QC）可監(jiān)測一定時間內(nèi)儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。下面將介紹如何運行質控微球，調(diào)整光電倍增管（PMT）的電壓，從而追蹤一定時間內(nèi)PMT電壓的波動，以及如何確認激光延遲時間和面積因子。分析30-60次QC數(shù)據(jù)以判斷其趨勢。在做儀器QC的時候，盡可能保證多參數(shù)的穩(wěn)定性。比如，盡量使用同一種微球，同樣的批號，同樣的鞘液壓力和同樣的樣本流速。如果需要改變鞘液壓力，那么您可以考慮在每一種壓力條件下，單獨建立一個“Experiment (實驗)”。1、樣本制備（2管）：向1ml鞘液中中加入2滴混混合均勻的RRainboow熒光微球球（BD

2、 PPharmiingen Cat. No.5556291）；檢測4888nm藍色色激光和6333nm紅色色激光向另一管1mll鞘液中加入入2滴混合均均勻的UV熒光微球球（BDISS Cat. No. 3446669）；檢測4077nm紫色激激光 上機檢測前充充分混勻微球球。在“瀏覽器（bbrowseer）”里建文件夾夾（QC）和和實驗組（bbeads），樣樣本（日期），2個采集管（Rainbow和Violet），并重命名（選中后，點右鍵Rename重命名），將“通用工作頁面（Global sheet）”命名為Rainbow，再添加一個“通用工作頁面（Violet）”。選擇Instrrumen

3、ttInstrrumentt Conffiguraation，確確保當前的儀器設設置包含合適適的參數(shù)，選選擇FACSSAria Classs。將“瀏覽器”的的采集箭頭選選中采集管，點擊“儀器框（instrument）”的“參數(shù)（parameter）”頁面。 除FSC、SSSC散射光參參數(shù)外，刪除除不必要的熒熒光參數(shù)，保保留以下三個熒光參數(shù)： FITC；檢查4888nm激光光； APC；檢查6333nm激光光； DAPI；檢查407nnm激光。所有參數(shù)均選擇擇線性，所有參數(shù)均選A面面積信號，F(xiàn)SC和熒光光參數(shù)還需選選擇H高度信信號。在“通用工作頁頁面Rainnbow”上建獲取模模板： 一共畫8個

4、個圖：第一個個為雙參數(shù)散散點圖（Doot Ploot），后7個為單參數(shù)直方方圖（hisstograam）。選中中工作頁面工工具欄中的繪繪圖工具，在在空白頁面上上單擊，即出出現(xiàn)相應圖形形，再調(diào)整大大小。 第一個圖，橫橫軸FSC-A，縱軸SSSC-A，在橫軸和縱軸均100,000左右位置，設單個微球的矩形門（rectangle gate）P（Parent）1； 點擊Ctrrl，一起選選中后七個圖，單擊擊右鍵，選擇擇“Show Popullationn（細胞群體體級別圖）”中的P1，即即后七個圖僅顯示示P1門內(nèi)顆顆粒；右鍵單擊任何一一張圖，選擇擇“Show Popullationn Hierrarc

5、hyy（顯示細胞胞群體級別）”，出現(xiàn)該圖，以明確層層包含的細胞歸屬級別。當一個“門”設設置完畢之后后，可以手動動改變其內(nèi)細細胞群體的顏顏色。雙擊“細胞群體級級別圖”上的顏色盒盒，從菜單中中選擇新顏色色。 第二個圖，橫橫軸FSC-A，在橫軸軸100,0000左右位置，做做間隔門（iintervval gaate）P22；第三個圖，橫軸軸FSC-HH，在橫軸1100,000左右右位置，做間間隔門P3； 第第四個圖，橫橫軸SSC-A，在橫軸軸100,000附近近，做間隔門門P4； 第第五個圖，橫橫軸FITCC-A，在橫橫軸100,000附近近，做間隔門門P5； 第第六個圖，橫橫軸FITCC-H，在橫

6、橫軸100,000附近近，做間隔門門P6； 第第七個圖，橫橫軸APC-A，在橫軸軸100,000附近近，做間隔門門P7； 第第八個圖，橫橫軸APC-H，在橫軸軸100,000附近近，做間隔門門P8。 選擇這八個圖，單單擊信息查看看窗口內(nèi)的“Titlee (標題)”頁面，選中中“Tube (采集管)”和“Popullationn (細胞群群體)”復選框，在在這八個圖的標題題位置均顯示示此兩項。在細胞群體級別別圖上，對PP1-P8進行重命名名（選中，再再點一下），例例如singgle beeads，F(xiàn)FSC-A，SSC-AA，F(xiàn)ITC-A，F(xiàn)ITTC-H等。 顯示統(tǒng)計圖圖：右鍵單擊任何一一張圖，選

7、擇擇“Creatte Stattisticcs Vieew（顯示統(tǒng)統(tǒng)計結果）”。右鍵單擊統(tǒng)計圖圖，選擇“Edit Statiisticss Vieww（編輯統(tǒng)計計結果）”。單擊“Editt Stattisticcs Vieew”窗口：“Headeer（表頭）”頁面，選擇需要項目。“Popullationn（細胞群體體）”頁面，可以不不選擇“# Eveents（細細胞數(shù)）”和“Pareent（%母母細胞群體，即即門內(nèi)細胞群群體）”。因細胞群體級級別圖中已顯顯示這幾項。“Statiisticss (統(tǒng)計)” 頁面，僅選擇所有實驗驗涉及到的參數(shù)數(shù)的“Mean (平均值)”選項。 在“通用工作頁頁面V

8、iolett”上建獲取模模板： 一共畫3個個圖：第一個個為散點圖，后后2個為直方圖圖。 第一個圖，橫橫軸FSC-A，縱軸SSSC-A，設單個微球的矩形門P1； 點擊Ctrrl，一起選選中后2個圖，單擊擊右鍵，選擇擇“Show Popullationn”中的P1；右鍵單擊任何一一張圖，選擇擇“Show Popullationn Hierrarchyy（顯示細胞胞群體級別）”。 第二個圖，橫橫軸DAPII-A，在橫軸軸100,0000左右位置，做做間隔門P22；第三個圖，橫軸軸DAPI-H，在橫軸1100,000左右右位置，做間間隔門P3。 選擇這三個圖，單單擊信息查看看窗口內(nèi)的“Titlee (

9、標題)”頁面，選中中“Tube (采集管)”和“Popullationn (細胞群群體)”復選框。在細胞群體級別別圖上，對PP1-P3進行重命名名（選中，再再點一下），ssinglee beadds，DAPPI-A，DAPPI-H等。 顯示統(tǒng)計圖圖：右鍵單擊任何一一張圖，選擇擇“Creatte Staatistiics Viiew”。右鍵單擊統(tǒng)計圖圖，選擇“Edit Statiisticss Vieww”，在“Statiisticss”頁面，選擇擇DAPI-A和DAPPI-H的“Mean”選項。7、檢測4888nm藍色激激光： 將第一管RRainboow微球放在流式細胞胞儀上，確認認使用“Ra

10、inbbow通用工工作頁面”。 確認“瀏覽覽器”中的綠色數(shù)數(shù)據(jù)采集箭頭頭指向Raiinbow檢檢測管；然后后單擊“Acquiisitioon Conntrol (獲取控制制)”窗口里的“Load (上樣)”鍵。載樣端端口便上升進進入進樣倉。樣樣品管進入進進樣倉后，獲獲取程序自動動啟動。將流流速設置為11.0。調(diào)整整過程中交替替點擊“Acquirre/restaart”，更新圖形形和統(tǒng)計。看通用工作頁面面中的第三（FFSC-H）、第四（SSC-A）張圖，點擊儀器框的參數(shù)頁面調(diào)整FSC和SSC電壓，使微球峰位于FSC、SSC直方圖的靶值處（100,000，看統(tǒng)計圖中顯示）。同時調(diào)整圖一（FSC-A

11、SSC-A）中P1的位置和大小，使其僅圈中單個微球。在數(shù)據(jù)采集控制制窗口，將顯顯示的顆粒數(shù)數(shù)（“Eventts to displlay”）設為500。數(shù)據(jù)據(jù)統(tǒng)計就會更更新的更快，從從而統(tǒng)計框中中的mean值與圖中中的顯示步調(diào)調(diào)更快地一致致。 若有必要，點擊擊儀器框的閾閾值（thresshold）菜單調(diào)整FSSC閾值。 檢查FSCC的面積因子子。 在統(tǒng)計圖圖中檢查第二張圖P2中FSC-A和第第三張圖中P3中FSC-H的meaan。如果這這兩種信號強強度是相等的的，那么就沒沒有必要調(diào)節(jié)節(jié)面積因子。如如果二者不相相等，按照下下列步驟進行行調(diào)節(jié)：單擊在“Insstrumeent (儀儀器)”窗口中的“

12、Laserr (激光)”頁面。在“FSC AArea SScaninng（面積因因子）”中選定當前前的數(shù)值，然然后輸入一個個新的數(shù)值。在直方圖上觀察察數(shù)值變更后后的結果。繼續(xù)調(diào)節(jié)面積因因子，直到FFSC-A和FFSC-H的信信號強度相等等。 檢查藍光的的面積因子。看第六張圖FIITC-H，點點擊儀器框的的參數(shù)頁面，優(yōu)優(yōu)化調(diào)整FIITC電壓，使微球峰位于相應熒光信號圖的靶值處（100,000）。在統(tǒng)計圖中檢查查第五張圖FITCC-A和第六張圖FITCC-H的平均均熒光強度。如如果這兩種信信號強度是相相等的，那么么就沒有必要要調(diào)節(jié)面積因因子。如果二二者不相等，按按照下列步驟驟進行調(diào)節(jié)：單擊在“In

13、sstrumeent (儀儀器)”窗口中的“Laserr (激光)”頁面。在“Area Scaniing（面積積因子）”中選定當前前的數(shù)值，然然后輸入一個個新的數(shù)值。在直方圖上觀察察數(shù)值變更后后的結果。繼續(xù)調(diào)節(jié)面積因因子，直到FFITC-AA和FITCC-H的信號號強度相等。 面積因子 調(diào)節(jié)前（左）和和后（右）的的藍色激光面面積因子8、檢測6333nm紅色激激光： 看“Raiinbow通通用工作頁面面”中第八張圖APC-H，優(yōu)化調(diào)調(diào)整APC電電壓，使微球峰位于相相應熒光信號號圖的靶值處處（100,000）。 檢查紅光的的面積因子。在統(tǒng)計圖中檢查查第七張圖APCC-A和第八八張圖中APPC-H的

14、平平均熒光強度度。如果這兩兩種信號強度度是相等的，那那么就沒有必必要調(diào)節(jié)面積積因子。如果果二者不相等等，按照7中步驟進行調(diào)節(jié)，直直到APC-A和APCC-H的信號號強度相等。 最優(yōu)化紅色色激光的激光光延遲時間設設置。在“Instrrumentt (儀器)”窗口內(nèi)選擇擇“Laserr (激光)”頁面。在“Delayy”中以“0.1”的數(shù)值間隔隔逐漸調(diào)節(jié)紅紅色激光的激激光延遲時間間數(shù)值，使第第七張圖APPC-A的平平均熒光信號號強度達到最最高值，提示示該激光延遲遲時間已設置置好。激光延遲時間 調(diào)試結束后后，在獲取控控制框里選擇擇獲取全部110000個個微粒停止，點擊獲取控制框的“Record”-記

15、錄數(shù)據(jù)；該窗口出現(xiàn)藍色進程顯示條。 數(shù)據(jù)記錄完完成后，單擊擊“Acquiisitioon Conntrol (獲取控制制)”窗口上的“Unloaad (卸載載)”鍵，取下管子。9、檢測4077nm紅色激激光：將第二管UV微微球放在流式式細胞儀上。確認“瀏覽器”中的綠色數(shù)數(shù)據(jù)采集箭頭頭指向Vioolet檢測測管；確認使使用“Violeet通用工作頁面面”；上樣。如需要，調(diào)節(jié)FFSC和SSSC電壓值，使第一張圖中的P1圈中單個微球。若有必要調(diào)整FSC閾值。看第三張圖DAAPI-H，優(yōu)化調(diào)整整DAPI電壓壓，使微球峰位于相相應熒光信號號圖的靶值處處（100,000）。檢查面積因子。在統(tǒng)計圖中檢查查第

16、二張圖DAPII-A和第三張圖DAPII-H的平均均熒光強度。如如果這兩種信信號強度是相相等的，那么么就沒有必要要調(diào)節(jié)面積因因子。如果二二者不相等，按按照7中步驟進行調(diào)節(jié)，直直到DAPII-A和DAPPI-H的信信號強度相等等。 最優(yōu)化紫色色激光的激光光延遲時間設設置。在“Instrrumentt (儀器)”窗口內(nèi)選擇擇“Laserr (激光)”頁面。在“Delayy”中以“0.1”的數(shù)值間隔隔逐漸調(diào)節(jié)紫紫色激光的激激光延遲時間間數(shù)值，使第第二張圖P2中DAPI-AA的平均熒光光信號強度達達到最高值，提提示該激光延延遲時間已設設置好。 調(diào)試結束后后，選擇獲取取全部100000個微粒粒停止，記錄錄數(shù)據(jù)，取下下樣本管。10、在“Innstrumment”菜單下選擇擇InstrrumenttInstrrumentt Stattus Reeport，打打印或記錄各激光和熒光光的設置，存存檔，推薦每每23周進行行一次QC，使使得面積因子子和激光延遲遲時間處于正正確設置狀態(tài)態(tài)。11、再次使用用QC管： 選擇EdiitUser Prefeerencees，取消RRemovee tubee-speccific settiings