1、本次實驗課流程課件講述 40min 實驗演示 20min流式細胞儀硬件及軟件介紹 30min上機檢測 40min解惑答疑 15min1 醫學結構生物學研究中心 柳衛凰細胞表面分子的檢測與分析2流式在細胞表面分子檢測中的應用免疫細胞及其亞群的檢測與功能分析例如：T細胞、B細胞、NK細胞、DC細胞等血液系統細胞表面標志的研究例如：急性白血病的初步診斷與檢測、CD34+造血干細胞研究、血小板分析輔助診斷相關疾病等細胞群體及細胞表面標志變化的監測例如：測定因試驗或臨床治療引起的某些細胞表面標志的變化細胞表面標志構成性質的分析例如：蛋白、糖蛋白、類脂結構、性質、比例的分析3標本來源外周血 全血溶血、PB

2、MC骨髓穿刺液 體液、灌洗液實體組織 新鮮組織、石蠟包埋樣本培養的細胞 原代細胞 細胞系：貼壁細胞、懸浮細胞 4一、新鮮實體組織樣本的制備 酶消化法。 常用的酶類試劑：胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶等 機械法。1、剪碎法 2、網搓法 3、研磨法 化學處理法。 常用試劑：0.2%EDTA 0.25%胰酶+0.2%EDTA注意：除消化過程外，其余步驟最好在4度環境下操作，提高 細胞活性。 標本制備5 標本制備二、全血標本的制備 “ABC”溶血（Beckman） 取肝素鈉抗凝的外周血100ul，熒光標記完成后，依次加入A液600ul，輕輕振蕩15s；B液260ul, 輕輕振蕩15s；C液

3、100ul, 振蕩10s，免洗上機檢測。 “ACK”溶血（自配） 以1：3的比例取肝素鈉抗凝的外周血與ACK溶血劑混勻，室溫放置10min，離心去上清，再加入溶血劑溶血，反復23次，至紅細胞完全溶解。細胞重懸后，再進行熒光標記。6標本制備三、外周血單個核細胞的制備（1）取外周血2ml，肝素抗凝，生理鹽水稀釋成4ml，混勻；（2）沿試管壁緩緩加入4ml淋巴細胞分離液Ficoll，勿用力過大；（3）離心2000r/min，20min，離心后分層，上層為血漿層，中層 為分離液層，底層為紅細胞層；（4）用吸管將上層與中層之間的單個核細胞層吸出，用生理鹽水 洗兩遍，PBS重懸；（5）熒光標記。7四、貼壁

4、細胞單細胞懸液的制備 （1）將培養細胞用0.04EDTA或0.25胰酶消化37分鐘， 至光鏡下見到貼壁細胞變圓還沒有漂浮為止，棄消化 液，加PBS； （2）用吸管將細胞從瓶壁上輕輕吹打下來，移入離心管中； （3）離心，1000r/min，5min； （4）加PBS洗兩遍； （5）PBS重懸，將細胞吹打均勻； （6）熒光標記。標本制備8標記方法直接免疫熒光法 特點：操作簡單、省時；特異性強；結果判斷較簡單。間接免疫熒光法 特點：適用范圍廣；抗體相對便宜；操作費時；易產生非特異性染色，結果不易判斷。（建議只用于單標檢測）直接、間接混合染色法 染色原則：一般情況下先間接后直接，特殊情況下可先直 接標

5、記。推薦！9對照設置陰性對照 調節熒光探測器放大倍數，確定帶測標本的基礎熒光域值。常用的有：同型對照、封閉抗體對照、陰性細胞對照陽性對照 檢測抗體特異性或確定實驗方法的穩定性、準確性。空白對照 確定待測標本的基礎熒光域值或檢測染色方法是否成功。 補償對照 多色熒光標記時，用于熒光光譜重疊的調節。10同型對照（Isotype Control）用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體而產生的背景染色與染色的單克隆抗體 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標記 相同劑量和濃度 由未免疫動物血清純化而來11雙色標記熒光補償 口訣：橫平豎直12熒光補償對照13注意事項樣本的采集、儲存樣

6、本的染色全血樣本的溶血效果流式實驗對照的設置14樣本的采集手術切除的新鮮標本取材時，要避免出血或組織壞 死。深低溫保存，以免組織發生自溶，DNA降解，造成檢測結果的誤差。采集靜脈血樣本時，要避免發生溶血。收集培養的細胞時，要注意選擇消化的方法和試劑。15樣本的儲存原則：時間越短越好肝素抗凝的外周血和骨髓：室溫 72小時EDTA抗凝的標本：室溫 24小時ACD抗凝的外周血：室溫 72小時ACD不推薦用作骨髓穿刺液的抗凝粒細胞、血小板功能檢測：即刻檢測單核細胞表面抗原分析： 1小時，4嗜酸性粒細胞表面抗原分析： 24小時，4淋巴細胞免疫表型與DNA含量的分析： 72小時16樣本的染色影響抗原抗體反

7、應的因素 電解質、反應溫度與時間 、PH值（7.27.4）流式抗體的選擇 根據流式細胞儀的類型選擇抗體 抗體應用級別、滴度和使用量的選擇 根據抗原表達量選擇抗體17 溶血，即裂解紅細胞。它是流式細胞術分析白細胞的先決條件。溶血不好，白細胞群不能很好分開，溶血好壞直接影響檢測結果。因此，必須對溶血過程進行嚴格控制。 全血樣本：溶血效果很重要影響溶血的因素：采血過程 溶血劑的使用 實驗操作過程1819結語流式細胞術的樣本制備沒有一個黃金標準最佳樣本制備方法需要根據具體情況獨立設定評估20常用的熒光染料 熒光染料 激發波長 (nm) 發射波長(nm) 用途 顏色 FITC 488 525 免疫熒光

8、綠色 PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅 PeCy5 488 675 免疫熒光 紅 PI 488 620 DNA染色 橙紅 PECy7 488 755 免疫熒光 深紅 PerCP 488 670 免疫熒光 深紅21參考書籍實用流式細胞術彩色圖譜王書奎主編 流式細胞術基本原理與實用技術梁智輝主編臨床流式細胞分析 王建中主編流式細胞術 杜立穎主編22實驗：人外周血T淋巴細胞亞群的 檢測與分析23淋巴細胞單核細胞粒細胞這三群細胞分別由具有不同功能的細胞組成這些細胞數量不等，甚至非常稀少這些細胞表達不同的標記物，是用來區分它們的基礎2425261.取

9、新鮮抗凝血100ul，置于FCM測量管中；2.直接標記法：加入帶熒光標記抗人的單克隆抗體 10ul，充分混勻，4閉光孵育2030min; 3.加入溶血劑A液600ul, 輕輕振蕩15s, 加入溶血劑B液260ul, 輕輕振蕩15s， 加入溶血劑C液100ul, 振蕩10s,上機檢測。 ACK溶血劑:加入2mlACK溶血劑，充分混勻，反應5min, 1000r/min離心5min，去上清；重復一遍，用PBS洗滌1遍，收集細胞上機檢測。實驗步驟27ABC溶血劑配方A: 0.12%甲酸 (超純水配置)B:碳酸鈉 6.0g/L ; 氯化鈉14.5 g/L ; 硫酸鈉 31.3g/L (超純水配置)C:多聚甲醛 10.0g/L( PBS配置) 28ACK溶血劑配方150mM(8.025g)NH4Cl 10mM(1.01g) KHCO30.1mM(0.0372g)Na2EDTA調PH至7.2-7.4，定容至1000ml無菌濾膜濾過，4保存29 實驗分組A:同型對照管或空白對照(調節電壓)B: 單標補償管(電壓不變,調節熒光補償)C: 雙標樣本檢測管30熒光補償31“A門”內CD3/CD4的表達32“A門”位置變化引起的改變33“A門”位置變化引起的改變3