1、實 驗 二微生物培養基的配制和滅菌一、實 驗 目 的了解培養基的配制原理和方法，掌握其配制過程。掌握加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。（一）培養基的配制二.實 驗 原 理1. 培養基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養料。不同微生物對營養物質的要求各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養角度分析，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。 培養基按成分可分為天然培養基、合成培養基和半合成培養基；按物理狀態可分為固體培養基、半固體培養基（0.

2、2%0.5%的瓊脂）和液體培養基；按用途可分為基礎培養基、營養培養基、鑒別培養基和選擇培養基等。培養基 是指由人工配制的、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物用的混合營養料。培養基簡介碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水營養物質的濃度要適宜營養物質之間的配比要適宜培養基的pH值、滲透壓、水活度和氧化還原電勢等物理化學條件要適宜。細菌： pH 7.08.0放線菌：pH 7.58.5酵母菌： pH 3.86.0霉菌：pH 4.05.8藻類： pH 6.07.0原生動物： pH 6.08.0初始pH通常培養條件：培養基的種類按照培養基的物理狀態可分為 1.液體培養基：不加凝固劑的液體狀態培養基。 2.

3、固體培養基：在液體培養基中加入2%左右的凝固劑的固體狀態的培養基。 3.半固體培養基：在液體培養基中加入0.20.5%凝固劑而成的半固體狀培養基。 瓊脂是最優良的凝固劑，自1880年開始用于配制微生物培養基以來，至今經久不衰。實驗室的常用培養基：細菌： 牛肉膏蛋白胨培養基；放線菌：高氏1號合成培養基培養；酵母菌：麥芽汁培養基；霉菌： 查氏合成培養基；稱量-配置-調節pH值-過濾-分裝-滅菌1.稱量 按照培養基配方，準確稱量各成份放于燒杯中。對于不是粉狀（如肉膏），應用燒杯稱量。培養基配制的基本步驟2.配調 向燒杯中加入適量的水，攪拌，使其溶解（可加熱助溶）。 如是配制固體培養基，在瓊脂的熔化時

4、，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。 如果配方中含有淀粉，先將淀粉用少量冷水調成糊狀并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其他藥品，待完全熔化后補足所失水分。3.調節pH值 培養基溶解均勻并冷卻至室溫時用pH試紙測pH，然后根據要求加酸或堿（一般用1molHcl和1molNaOH），要緩慢少量且多加攪拌。培養基配方為自然pH時，不用調節。 4.過濾 用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。5.分裝 將制好的培養基分裝入試管內或三角瓶內，管（瓶）口塞上棉塞。固體培養基要趁熱裝。 分裝時要避免培養基粘染管（瓶）口，引起污染。分裝量可分為下面幾方面：（1）斜面：

5、裝量為管長的1/4-1/5。（2）液體培養基、高層培養基、半固體培養基：裝載量不超過管長的1/3。（3）三角瓶：裝量不超過容積1/2。6.滅菌 塞棉塞，包扎，滅菌。 高壓蒸汽滅菌法：是在密閉的加壓容器內進行，加熱使器內的水產生蒸汽，由于密閉，增加了器內的壓力，使水的沸點升高，從而獲得高于100度的蒸汽溫度。牛肉膏蛋白胨固體培養基配方：牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1g 氯化鈉 0.5g 瓊脂 2g 水 100mL pH 7.27.4 滅菌 121，20min牛肉膏蛋白胨半固體培養基配方： 瓊脂 0.3g牛肉膏蛋白胨液體培養基配方： 瓊脂 0g牛肉膏蛋白胨培養基的配制1、固體培養基（平板制作）2、固

6、體培養基（斜面制作）2、半固體培養基3、液體培養基三.操作步驟及本次實驗具體安排（一）平板固體培養基制作 1. 按配方稱取各組分(按100ml計算)到的三角瓶中. 2. 加入100mL水. 3. 在酒精燈上完全融化，取部分制作斜面培養基 3.其余部分塞上硅膠塞,用牛皮紙包扎好; 4.高壓蒸汽滅菌 5.滅菌后,當培養基冷卻至50左右時,傾注平皿(每100ml可制備5-6個平皿) 6.凝固后放冰箱備用 （二）斜面培養基制作1. 在空試管內倒入23mL上述已經溶解好的培養基，【注意盡量不要讓培養基沾到試管口】塞好硅膠塞.2.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.3.擺斜面,凝固后放冰箱備用.用于活化菌種，或培養

7、菌種的斜面用于保存菌種的斜面擱置斜面 當培養基冷卻至50左右時，將試管帶棉塞的一端擱在一根木棒上。擱置的長度要合適，使培養基形成的斜面的長度不超過試管總長的一半。（三）液體培養基制作1.按牛肉膏蛋白胨液體培養基配方稱取相應成分到250ml的三角瓶中.2. 加入100mL水.3. 充分溶解.（取出50ml用于半固體培養基制作）4. 在空試管內倒入23mL已經溶解好的培養基，【注意盡量不要讓培養基沾到試管口】塞好硅膠塞.5.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.6. 冷卻后放冰箱備用.牛肉膏蛋白胨液體體培養基按下列配方及方法配制牛肉膏: 0. 3g蛋白胨: 1gNaCl: 0.5g水: 100mlpH: 7.

8、0-7.2放入水浴鍋內溶解后,分裝到試管中,滅菌備用.（三）半固體培養基制作1. 在25ml液體培養基中加入0.3%的瓊脂粉3. 完全溶解.4. 在空試管內倒入23mL已經溶解好的培養基，【注意盡量不要讓培養基沾到試管口】塞好硅膠塞.5.放入燒杯中,高壓蒸汽滅菌.6.凝固后放冰箱備用.牛肉膏蛋白胨半固體培養基按下列配方及方法配制牛肉膏: 0. 3g蛋白胨: 1gNaCl: 0.5g瓊脂: 0.3g水: 100mlpH: 7.0-7.2放入水浴鍋內溶解后,分裝到試管中,滅菌備用.注：試管加棉塞(最好) 培養基分裝完畢以后，在管口上加一個棉塞。棉塞能防止雜菌污染，保證通氣良好。加棉塞時，應使棉塞長

9、度的2/3在試管口內，如下圖所示。配制好后，寫好培養基名稱、班級、組別，再滅菌每組留部分同學等滅菌結束之后，倒固體平板和擺斜面任何一種培養基一經制成就應及時徹底滅菌，以備純培養用。一般培養基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。常用的滅菌的方法有：干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、常壓蒸汽滅菌、常壓間歇式滅菌超高溫滅菌、過濾除菌、輻射滅菌、化學藥品滅菌等方法。本實驗培養基的滅菌常使用的是高壓蒸汽滅菌，它是利用高溫濕熱空氣使菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的。（二）培養基的滅菌高壓蒸氣滅菌 一般培養基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min 含糖培養基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min 培養基的滅菌器皿的滅菌： 干熱空氣： 160， 2 小時無菌室的消毒： 紫外光 化學藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）滅菌鍋濕熱滅菌使用的設備 操作過程 加水裝鍋蓋蓋加熱當壓力升為0.5kg/cm2時排放冷空氣正式升壓保壓（1.1kg