1、PAGE PAGE - 16 -響應面優化混菌發酵蜂王幼蟲制備抗氧化肽及其結構鑒定蜂王幼蟲又稱蜂子、蜂王胎或蜂皇胎，由蜜蜂的受精卵孵化約3日齡而成的幼蟲體，始終以工蜂分泌的蜂王漿為食物，是蜂王漿生產過程中的必然產品。我國蜂王漿年產量約3000t，產量和出口量占全球總量的90%以上，一般每生產1kg蜂王漿，可收獲蜂王幼蟲0.20.3kg1。蜂王幼蟲營養成分豐富，是一類高蛋白且氨基酸組成全面、維生素含量豐富的可食用昆蟲，然而其蛋白制品通常只是進行簡易的加工，技術含量和附加值低，近年來蜂王幼蟲肽產品開發受到關注。主要研究側重于不同的商業酶酶解蜂王幼蟲的工藝優化以及活性研究，但得到的多肽抗氧化活性并不

2、強，對多肽的結構表征也少2。已有研究發現，從蠶蛹、蜂蛹、黃粉蟲等昆蟲蛋白中制備得到的活性肽均表現出較好的抗氧化活性，生產應用前景廣闊3-5。蜂王幼蟲和蜂蛹相似，都是蜜蜂發育過程中的幼蟲體，富含高度同源的蛋白質，值得開發利用，而且我國蜂王幼蟲資源充足，與畜牧行業生產動物性蛋白相比碳排放量低，可實現綠色生產，有工業化生產潛力，然而大多數的蜂王幼蟲蛋白資源仍未得到有效利用。相比酶解法，微生物發酵法所產蛋白酶系豐富，能將微生物產酶和酶解蛋白工藝同時進行，酶解效率更高，省去酶的分離和提純的步驟，降低了生產成本6；微生物發酵法在蜂王幼蟲活性肽產品開發和應用上研究較少，這也為工業化生產蜂王幼蟲活性肽提供一條

3、可行的途徑。枯草芽孢桿菌和黑曲霉都是蛋白酶分泌能力強的菌株7，根據它們的產酶特點復配使用，理論上會使多肽不僅得率高而且風味好。蛋白酶可以水解蛋白質產生小分子的活性肽和氨基酸8，蛋白酶活力和多肽的產率成正比，要提高多肽的得率就要調控發酵條件提高微生物產蛋白酶的活力。本文利用枯草芽孢桿菌和黑曲霉復配發酵蜂王幼蟲凍干粉制備抗氧化肽，重點研究不同發酵條件對多肽得率和發酵體系中蛋白酶活力的影響，并對目標抗氧化肽進行分離純化，測定其體外抗氧化活性并表征其結構，期望為蜂王幼蟲的生物活性研究、開發高營養、高附加值的產品提供新的思路。1材料與方法1.1實驗材料1.1.1主要實驗材料蜂王幼蟲凍干粉，湖北某蜂業公司

4、；枯草芽孢桿菌M2022782,本實驗室從蜂糧中分離鑒定，保藏于中國典型培養物保藏中心；黑曲霉91006，中國典型培養物保藏中心；其余試劑均為國產分析純。1.1.2儀器與設備YXQ-LS-30S立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HZQ-160全溫振蕩培養箱，太倉市實驗設備廠；MultiskanGO全波長酶標儀，美國ThermoFisher公司；AllegraX-15R低溫高速離心機，美國貝克曼公司；BONA-GM-18有機膜分離試驗機，濟南博納生物技術有限公司；A300全自動氨基酸分析儀，德國曼默博爾公司；AL204真空冷凍干燥機，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Ulti

5、mate3000液相色譜儀、QExactive質譜儀，美國ThermoScientific公司。1.2實驗方法1.2.1種子液的制備7挑取35環活化后的菌種接于已滅菌的裝有100mL液體種子培養基的250mL錐形瓶中，放入恒溫振蕩搖床中進行擴大培養一段時間，即得到種子液。1.2.2制備工藝蜂王幼蟲粗肽樣品制備工藝如下：蜂王幼蟲凍干粉加水混合(發酵總量50mL/250mL錐形瓶)高溫滅菌(105，20min)接種發酵沸水浴(100，15min)冷卻離心(4000r/min，15min)取上清液蜂王幼蟲粗肽樣品1.2.3蜂王幼蟲多肽得率的測定參考徐萍9的方法測定蜂王幼蟲多肽得率，以肽的質量濃度為橫

6、坐標X(mg/mL)，OD值為縱坐標Y，制作標準曲線y=0.0637x-0.0018(R2=0.9987)。樣品的測定：取2mL發酵上清液，加入1mL10%的三氯乙酸(trichloroaceticacid，TCA)，混勻后靜置30min，沉淀大分子蛋白，4000r/min離心15min，取上清液1.5mL，并加入1mL雙縮脲試劑V(樣液)V(雙縮脲試劑)=32，混勻后室溫靜置30min，測定540nm處的吸光值，代入標準曲線計算上清液多肽濃度。根據公式(1)計算多肽得率：多肽得率(1)式中：c，發酵液中多肽質量濃度，g/mL；V，發酵粗肽液體積，mL；X1，蜂王幼蟲蛋白質的質量分數，%；m，

7、蜂王幼蟲原料質量，g。1.2.4蛋白酶活力的測定參照GB/T235272022蛋白酶制劑中的福林法進行測定。根據不同L-酪氨酸濃度對應波長680nm處的吸光值繪制標準曲線y=0.0071x-0.0012(R2=0.9997)。1.2.5發酵工藝的優化在發酵總量50mL、料水比5%、搖床轉速180r/min、pH為6.5、發酵溫度30、初始枯草芽孢桿菌黑曲霉復配體積比=21、接種量5%(體積分數)、發酵時間60h等基礎條件下，考察復配體積比(11、12、21、31、13)、接種量(3%、5%、7%、9%、11%)和發酵時間(24、36、48、60、72h)對發酵液多肽得率和蛋白酶活力的影響。在單

8、因素試驗的基礎上，采用響應面分析法中Box-Benhnken試驗設計優化發酵工藝。1.2.6氨基酸組成的測定測定參照GB5009.1242022食品中氨基酸的測定。1.2.7超濾分離在室溫條件下，選擇10、5、3、1kDa的卷式超濾膜將發酵液進行逐級分離，分別得到5個分離級分，分別是分子質量10kDa的組分F5，510kDa的組分F4，35kDa的組分F3，13kDa組分F2，1kDa組分F1。濾液流速為0.58L/h，膜元件壓力00.8MPa。將收集到的各個組分濃縮、真空冷凍干燥得到各組分的凍干粉，-20保存，測定其抗氧化活性。1.2.8體外抗氧化活性測定1.2.8.1DPPH自由基清除率的

9、測定將經過超濾處理的不同組分的粗多肽凍干粉依次配成0.5、1、1.5、2、2.5mg/mL的多肽液。參考涂宗財等10的方法，分別測定50L各濃度待測粗肽液與150L的0.2mmol/LDPPH反應后吸光值A1。以50L去離子水與150LDPPH溶液混合作為空白對照組A2，以50L粗肽樣品與150L95%乙醇混合作為本底對照組A0。按公式(2)計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率(2)計算半抑制濃度(halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50)，IC50越小表示DPPH自由基清除力越強。1.2.8.2ABTS陽離子自由基清除率的測定稱取經過超濾處理的

10、不同組分蜂王幼蟲粗多肽凍干粉，分別配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL多肽液，參考白海娜等11的方法，分別測定50L各濃度待測粗多肽液與100LABTS陽離子工作液反應后的吸光值A1，以50L去離子水與100LABTS陽離子工作液混合作為空白對照組A2，以50L粗肽樣品與100L去離子水作為本底對照組A0，按公式(3)計算ABTS陽離子自由基清除率：ABTS陽離子自由基清除率(3)1.2.8.3還原力的測定參考LASSOUED等12的氰化鉀氧化法，向試管中加入1mL2mg/mL粗多肽液并依次加入各反應液后，靜置10min，以蒸餾水代替樣品作為空白，700nm測定吸光值，吸光值越

11、大，說明樣品還原力越強。1.2.9蜂王幼蟲低聚肽序列LC-MS/MS鑒定13抗氧化活性最好的超濾組分多肽序列采用LC-MS/MS進行鑒定。色譜條件：流動相：流動相A：0.1%甲酸，流動相B：0.1%甲酸、80%乙腈(acetonitrile，ACN)，流速300nL/min；洗脫時間05min，5%B；545min，5%50%B；4550min，50%90%B；5055min，90%B；5565min，90%5%B。質譜條件：分離后的肽段直接進入質譜儀ThermoScientificQExactive進行在線檢測，參數如下：(1)一級質譜參數：分辨率：70000；自動增益控制(autogain

12、control，AGC)target：3e6；最大駐留時間(maximumIT)：40ms；掃描范圍：1002000m/z；(2)二級質譜參數：分辨率：17500；AGCtarget：1e5；最大IT：60ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：27。數據庫檢索軟件為Mascot。1.2.10實驗數據處理所有實驗進行至少3次重復，實驗結果以平均值標準差(meanSD)表示，利用IBMSPSSStatistics20.0對實驗結果進行顯著性分析，P0.05表示各組數據之間的差異具有統計學意義。圖表采用GraphPadPrism8繪制及DesignExpert10進行響應面優化。2結果

13、與分析2.1單因素結果分析2.1.1復配比對混菌發酵蜂王幼蟲凍干粉的影響枯草芽孢桿菌和黑曲霉所產蛋白酶的性質差異較大，前者主要為內肽酶，而且蛋白酶活力高，能夠增加蜂王幼蟲多肽的產率，但發酵產物臭味重，很難除去；后者則為端肽酶，可以改善蜂王幼蟲多肽的風味。由圖1可知，當枯草芽孢桿菌的接種量黑曲霉時，多肽得率和酶活力較高，在接種比為21時，達到最大值。這一結果與采用用枯草芽孢桿菌和黑曲霉混合發酵綠豆蛋白粉時結果吻合，同樣是枯草芽孢桿菌比例高時多肽濃度更高14。這可能是因為枯草芽孢桿菌在發酵初期利用營養物質及生長繁殖能力強于黑曲霉，會成為主要優勢菌，增加多肽的產率。選擇枯草芽孢桿菌與黑曲霉的接種比例

14、為11、21以及31作為響應面試驗的3個水平。圖1復配比對酶活力和多肽得率的影響Fig.1EffectofBacillussubtilistoAspergillusnigerratioonenzymeactivityandpeptideyield注：不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)(下同)2.1.2接種量對混菌發酵蜂王幼蟲凍干粉的影響適宜的接種量可以將微生物的延滯期變短，能更快利用底物進行發酵。如圖2所示，在接種量為3%7%時，發酵液的多肽得率和蛋白酶活力呈現上升的趨勢，達到7%后，隨著接種量的增加，其多肽得率和酶活力不再增加。這一變化趨勢與枯草芽孢桿菌發酵燕麥制備血管緊張素轉換酶(an

15、giotensinconvertingenzyme，ACE)肽接種量與多肽得率變化結果相似15。當接種量濃度太低時，底物中的蛋白質無法被枯草芽孢桿菌和黑曲霉完全利用，只有部分得到水解；接種量超過一定濃度時會使微生物生長繁殖過快，得到的蜂王幼蟲多肽可能會被菌體優先利用，此外培養基黏度增大，溶解氧不足，微生物生長受到抑制，導致酶活性和多肽得率不高。根據接種量對發酵產物的影響，響應面試驗中接種濃度選定為5%9%。2.1.3發酵時間對混菌發酵蜂王幼蟲凍干粉的影響合理把控發酵時間是在充分發酵物料的基礎上，避免營養物質浪費、保證發酵產物質量的關鍵因素。如圖3所示，發酵時間在2460h，枯草芽孢桿菌和黑曲霉

16、快速繁殖，產生大量的蛋白酶，因此多肽得率和發酵體系蛋白酶活力都呈現上升的趨勢，在60h達到最大。隨著時間的延長，微生物從穩定期進入衰亡期，蛋白酶產量和活力降低，培養基中的營養物質不斷被利用，而菌種的生化反應過程并未終止，可能積累其他影響發酵液質量的有害代謝產物，微生物生長受到抑制16。還有可能隨著時間的增加，產生的多肽類會被進一步水解成氨基酸，多肽得率有所下降17。因此選擇發酵時間為4872h。圖2接種量對酶活力和多肽得率的影響Fig.2Effectofinoculationamountonenzymeactivityandpeptideyield圖3發酵時間對酶活力和多肽得率的影響Fig.3

17、Effectoffermentationtimeonenzymeactivityandpeptideyield2.2響應面試驗結果與分析2.2.1響應面設計方案與結果在單因素試驗的基礎上，采用軟件DesignExpert10建立3因素3水平的實驗設計，以多肽得率(Y1)和酶活力(Y2)為考察指標，選取復配比(A)、接種量(B)、發酵時間(C)為響應變量，每個因素設置低(-1)、中(0)、高(1)3個水平，采用響應面分析法優化枯草芽孢桿菌和黑曲霉復配發酵蜂王幼蟲工藝。響應面試驗因素水平見表1，設計及結果見表2。表1響應面試驗因素水平表Table1Responsesurfacetestfactor

18、leveltable表2響應面試驗設計及結果Table2Responsesurfaceexperimentaldesignandresults2.2.2回歸模型分析及優化工藝條件確定與結果驗證利用Design-Expert10.0統計軟件將多肽得率和酶活力的實驗結果分別進行二次回歸擬合，并對二次多項回歸方程進行方差分析，所建立的模型能比較準確地分析和預測蜂王幼蟲液態發酵條件與多肽得率及酶活力的關系，并對正交試驗結果進行方差分析，明確了3個因素對多肽得率和酶活力影響的主次順序。在此基礎上，得到枯草芽孢桿菌和黑曲霉復配發酵蜂王幼蟲制備活性肽的最佳工藝條件為：復配比2.4261，接種量6.512%，

19、發酵時間57.553h，在此發酵條件下，多肽得率和酶活力的理論值是15.624%和128.38U/mL。為驗證響應面的可行性以及為方便操作，將發酵參數設為復配比2.41，接種量6.5%，發酵時間57.5h，在此條件下進行3次平行試驗，測得平均多肽得率為(15.4940.153)%，酶活力為(133.551.694)U/mL，均與理論預測值接近，由此說明用響應面回歸模型擬合良好，對最佳發酵條件的優化具有一定的實用指導意義。2.3蜂王幼蟲粗多肽的氨基酸測定氨基酸組成是影響多肽抗氧化活性的重要因素之一18。采用氨基酸分析儀測定最優條件下發酵后的蜂王幼蟲粗多肽凍干樣品，氨基酸組成結果如表3所示，發現含

20、量最高的是谷氨酸，達到14.17%，其次是脯氨酸(11.13%)、天冬氨酸(10.09%)、賴氨酸(8.78%)以及亮氨酸(7.84%)。抗氧化氨基酸的含量達到58.11%，疏水氨基酸為47.2%。有研究指出多肽序列碳端相鄰的氨基酸殘基為疏水性較低的氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸等)會提高多肽的抗氧化活性19，預示發酵得到的粗多肽樣品具有良好的抗氧化潛力。表3蜂王幼蟲粗多肽凍干粉氨基酸組成分析Table3Analysisofaminoacidcompositionofqueenbeelarvaecrudepeptidesfreeze-driedpowder注：*為必需氨基酸；抗氧化氨基酸包

21、括：天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸；疏水氨基酸：脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸2.4超濾分離純化組分的抗氧化性分析2.4.1不同分子段蜂王幼蟲多肽DPPH自由基清除活性由圖4可知，發酵液各組分對DPPH自由基的清除率與質量濃度呈現一定的線性量效關系。在相同濃度條件下，1kDa的組分表現出最強的DPPH自由基清除效果，并且與其他組分的抗氧化活性存在顯著性差異，其IC50為1.06mg/mL，結果見表4。產生上述差異的原因可能由于分子質量小的低聚肽對應的空間位阻小，能夠更好地靠近DPPH自由基，并與之發生反應20。雖然各組分對

22、自由基清除率均低于抗壞血酸的清除能力，但有研究指出當某種物質的自由基清除率IC50值10mg/mL時，即可推斷其具備一定的抗氧化能力21。可見，本實驗中獲得的蜂王幼蟲發酵產物對DPPH自由基清除能力較強，而且優于賈歌2制備的蜂王幼蟲酶解產物，其1kDa的組分DPPH自由基清除率的IC50值為21.86mg/mL。2.4.2不同分子段蜂王幼蟲多肽ABTS陽離子自由基清除活性由圖5可知，在含量為0.10.5mg/mL時，各組分對ABTS陽離子自由基清除率均呈現一定的正向劑量效應，其中，1kDa組分和13kDa組分的IC50值無顯著性差異，但當多肽質量濃度0.2mg/mL時，1kDa組分在所有濃度都

23、表現出最強的ABTS陽離子自由基清除能力，這可能是因為1kDa的肽段含有較多的游離氨基酸作為額外的電子和質子來源22。如表5所示，蜂王幼蟲發酵產物1kDa組分清除ABTS陽離子自由基的IC50值為0.165mg/mL，優于徐萍9制備的蜂蛹多肽(IC50=0.67mg/mL)。圖4不同分子段蜂王幼蟲多肽DPPH自由基清除活性Fig.4DPPHradicalscavengingactivityofqueenbeelarvaepolypeptideswithdifferentmolecularweights表4不同分子段蜂王幼蟲多肽清除DPPH自由基的IC50值Table4TheIC50valueo

24、fDPPHradicalscavengingactivityfromqueenbeelarvaepolypeptideswithdifferentmolecularweights注：不同字母標注表示在Duncan分析下存在顯著性差異(P0.05)(下同)圖5不同分子段蜂王幼蟲多肽ABTS陽離子自由基清除活性Fig.5ABTScationradicalscavengingactivityofqueenbeelarvaepolypeptideswithdifferentmolecularweights表5不同分子段蜂王幼蟲多肽清除ABTS陽離子自由基的IC50值Table5TheIC50value

25、ofABTScationradicalscavengingactivityfromqueenbeelarvaepolypeptideswithdifferentmolecularweights2.4.3不同分子段蜂王幼蟲多肽還原力當樣品具有一定的抗氧化能力時，可將鐵氰化鉀中的Fe3+還原成亞鐵形式，這種還原能力可以視為其具有潛在抗氧化活性的一個重要指標23。如圖6所示，在質量濃度均為2mg/mL時，蜂王幼蟲發酵產物的還原能力隨不同分子段的大小而有所差異，分子質量1kDa的組分還原力顯著高于其他超濾組分(P0.05)。在本研究中，2mg/mL的蜂王幼蟲1kDa組分多肽測得的吸光值為0.389，還

26、原力高于用酶解法制備的蜂蛹多肽9以及用枯草芽孢桿菌發酵虎斑烏賊得到的抗氧化肽24，說明蜂王幼蟲1kDa組分具有較好的還原能力。圖6不同分子段蜂王幼蟲多肽的還原力Fig.6Thereducingpowerofqueenbeelarvaepolypeptideswithdifferentmolecularweights2.5蜂王幼蟲抗氧化肽的結構鑒定采用LC-MS/MS對蜂王幼蟲發酵產物抗氧化活性最強組分F1進行分離鑒定，用MASCOT軟件檢索多肽數據庫，比對得到9個可能的肽段，多肽序列結果如表6所示。這些肽均為六肽以上，最長為十一肽，分子質量在6001100Da。多肽的抗氧化性與其氨基酸序列與組成存在構效關系，報道指出分子質量在5001800Da的低聚肽的抗氧化性強于母體