1、2021/9/131第七章 放射免疫分析試劑盒的制備一、概要二、放射免疫分析試劑盒主要組分的制備技術三、典型放射免疫分析試劑盒的制備四、免疫分析技術進展2021/9/132 放射性同位素在醫學上的應用 相機 1 體內診斷（核醫學影像學) SPECT PET 2 治療（放射治療藥物、種子源） 3 體外檢測（放射免疫分析） 2021/9/133一、 概要概要概念與原理主要的放射標記免疫分析方法放射標記免疫分析方法的特點2021/9/134放射免疫分析技術（RIA）是基于免疫分析的特異性與放射性測量的高靈敏性而建立的一種超微量分析方法，能夠定量檢測生物體內成百上千種活性物質，是現代生物、醫學和臨床診

2、斷的重要手段。1 概念與原理 以放射性核素（主要為125I, 57Co, 3H, 14C等）標記抗原，抗體，配基或受體，在體外條件下，經過不同的結合反應（競爭或非競爭性的），再將結合和未結合的標記物分開，測量其放射性活度，從而計算各種生物活性物質的含量。 基本原理2021/9/135 抗原(Antigen)：能刺激動物機體的免疫活性細胞產生抗體或致敏淋巴細胞，并在體內外與其發生特異性反應（結合）的物質。一般為異種或異體物質（即機體的免疫活性細胞從未接觸過的異物）。 完全抗原：具有上述兩種特性，即單獨能刺激動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞，又能與這些產物在體內外發生特異性結合生成抗原-抗體復合物。

3、大多為大分子量的蛋白質。 半抗原(Half Antigen, Hapten)：單獨不能刺激動物機體產生抗體或致敏淋巴細胞，但能與相應的抗體或致敏淋巴細胞起特異性結合反應生成抗原-抗體復合物的物質。與載體結合后注入動物體內能誘導抗體形成，即成為完全抗原。2021/9/136抗體(Antibody)：由抗原誘導形成的一種血清球蛋白，與抗原結合形成抗原-抗體復合物。特異性(Specificity)：抗體抗原反應具有特異性，即一種抗體（抗原）只能與相應的抗原（抗體）結合，不能與其它無關的抗原（抗體）結合。哺乳動物IgGIgAIgM人體IgGIgAIgMIgDIgE2021/9/137主要的放射免疫分析

4、方法放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA） 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 受體放射性配體結合分析（Receptor Radio-ligand Bonding Assay, PRLBA） 放射受體分析（Radio-Receptor Assay, RRA）2 主要的放射標記免疫分析方法2021/9/138 1958-1960年由Yalow RS and Breson SA創建，為最早的放射標記免疫分析方法。（1977年獲得了諾貝爾生物醫學獎）。 原理：用放射性核素標記抗原，標記抗原與非標記抗原同時競爭結合物（如抗體）上有限的結合

5、位點。然后將結合與未結合的游離抗原分離，測定其放射性分布，利用標準曲線確定樣本中待測物的含量。1) 放射免疫分析（Radioimmunoassay, RIA）Ag* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab游離物（F） 復合物（B）2021/9/139對于RIA，應滿足以下條件： 抗原是純一的，只由一種化學成分組成； 抗體也僅由一種化學成分組成； 抗原與抗體均為單價，即一分子抗原只能和一分子抗體反應； 標記的和未標記的抗原具有相同的物理-化學性質； 抗原-抗體反應遵循質量作用定律； 反應達到平衡； 結合抗原和未結合的游離抗原能完全分開，且不破壞反應平衡； 能準確測量結合抗原和游離抗原之比，

6、或結合抗原與總抗原之比。2021/9/1310K1Ag + Ab AgAb k-1 K（親和常數）= =(AgAb）/ Ag Ab k-1 b/f =（AgAb）/ ( Ag)=K(Ab) b/f=K(AbT-B)K12021/9/1311 放射免疫分析的Scatchard圖2021/9/13122) 免疫放射量度分析（Immunoradiometric assay, IRMA） 在RIA基礎上建立起來的標記免疫分析方法。原理：用放射性核素標記抗體，以過量的標記抗體與抗原結合建立的方法. 免疫放射量度分析原理示意圖2021/9/1313 IRMA劑量反映曲線 RIA反映曲線2021/9/131

7、4RIA與IRMA反應式比較方法反應式分離方法RIAAg* +Ag+ Ab Ag*-Ab + Ag-Ab（定量抗體）液相分離固相分離IRMAAg+ Ab* Ag-Ab* + Ab*Ag +Ab*+固相Ab 固相Ab-Ag-Ab* +Ab*（過量抗體）免疫吸附劑或固相分離RIA與IRMA的工作原理主要區別RIAIRMA1 競爭性免疫結合分析2 反應體系中有抗原、標記抗原和抗體3 標記抗原4 在標準曲線劑量反應體系中結合率越大，劑量越小，反之，則越大5 免疫結合反應慢1 非競爭性免疫結合分析2 反應體系中有固相抗原、抗原與標記抗體3 標記抗體4 在標準曲線劑量反應體系中隨結合率增高劑量值也隨之增大

8、5 免疫結合反應快2021/9/1315特點特異性很強，即使化學結構很接近；靈敏度高，可達10-14mol/L;精確度較高，放射性活度探測不易受干擾；應用范圍較廣，適用于多種化學結構；操作簡單，分析速度快，樣品不需預處理。3 放射標記免疫分析方法的特點2021/9/1316主要組分標記物標準品抗血清分離劑質控血清二、放射標記免疫試劑盒主要組分的制備技術2021/9/1317（一）標記物的制備技術核素半衰期衰變方式及分支比主要射線及能量(keV, %) 生產方式3H12.3y-(100)- 18.61(100)6Li(n, a)3H14C5730y+(99.8)EC(0.2) - 155(100

9、)14N(n, p)14C35S87.5d-(100)- 167.4(100)35Cl(n, p)35S57Co271.8dIT(100) 122(85.5)56Fe(d, n) 57Co75Se119.8dEC(100) 136(58)74Se(n, r)75Se125I60.1dEC(100) 28-35124Xe(n, r)125Xe 125I 可用于放射免疫分析的放射性核素射線易于探測半衰期適中易于標記2021/9/1318蛋白質的I標記直接氧化親電法間接標記法氯胺T法（Chloramine-T, Ch-T）酶促標記法Iodogen(氯甘尿法)Bolton-Hunter（BH）方法 其

10、它間接標記法 1 125I的標記2021/9/13192 標記物的分離純化分離純化方法離子交換色譜法凝膠色譜(Sephadex)法薄層色譜法高效液相色譜(HPLC)2021/9/13203 標記物的質量鑒定質量評價參數核素(125I)利用率放化純(85%)比活度(80%)免疫活性(過量抗體結合率)4 標記物的穩定性及貯存條件多肽類標記物通常采用冷凍干燥方法貯存;小分子化合物及單抗標記物可以液體狀態貯存;標記物通常在2-8條件下保存，有效期約周。2021/9/1321（二）抗原和抗體的制備技術免疫原（抗原）的制備免疫原的制備采用生化技術提取(人體器官或體液）采用偶聯技術制備親和層析法分子篩法離子

11、交換法高效液相色譜法2021/9/13222 抗體制備抗體多克隆抗體單克隆抗體 動物種屬選擇動物家兔綿羊豚鼠等2021/9/1323 免疫增強劑注射方式皮內注射皮下注射腹腔注射靜脈注射 凡可增強被免疫動物免疫應答反應的物質均可稱為免疫增強劑， 其種類眾多。 免疫注射部位背部腹股溝足墊2021/9/1324抗血清的質量鑒定質量鑒定親和性特異性滴度抗體貯存抗血清加入0.1%-0.2%防腐劑，按需要量分裝、凍干，-50貯存。2021/9/1325（三）單克隆抗體的制備 1975年由Kohler和Milsten采用雜交瘤技術第一次獲得。 基本原理：利用動物脾細胞即淋巴細胞可以分泌特異抗體，而骨髓瘤能夠

12、在體外連續培養的性質，將兩種細胞在融合劑（通常為PEG）的作用下進行融合，獲得既可分泌特異抗體又可在體外連續進行培養的雜交瘤細胞。因此，這種雜交瘤細胞就能在細胞培養中產生大量單一類型的高純度抗體。 單克隆抗體是僅由一種類型的細胞制造出來的抗體，對應于多克隆抗體/多株抗體由多種類型的細胞制造出來的一種抗體。 2021/9/1326小鼠免疫細胞融合篩 選克隆化擴大培養注如小鼠誘發腹水單克隆抗體制備過程質量鑒定抗體滴度親和常數交叉反應免疫球蛋白類型、亞類2021/9/1327特 點高度勻質性高度特異性來源穩定、可大量生產缺點熱穩定性較差親和性較低價格較高與多克隆抗體比較2021/9/1328（四）分

13、離劑 分離劑的作用是將分析體系中游離部分與結合部分進行有效的分離，直接影響RIA測量結果的準確性。分離劑PR試劑(雙抗體與聚乙二醇 沉淀法)磁性分離劑試管固相法分離效果好操作簡便易于大批量自動化分析2021/9/1329（五）標準品與參考血清的制備1 標準品要 求與被測物具有相同的化學結構和免疫活性來源充足、價格便宜穩定、均勻一致量值準確標準品化學純品制備（被測物質結構清楚、可用化學方法合成）類似物制備（被測物質結構不確定、難以用化學方法合成）2021/9/13302 參考血清 一般含一個或幾個分析物，是免疫分析中用來比較和評價不同測定系統的偏倚和重復性的血清，也是用于內部或外部質量評價的主要

14、試劑。作用計算實驗結果誤差（批內、批間精密度）分析誤差原因并進行處理監督放免試劑盒穩定性判斷分析數據可靠性要求與待測物質相近配制的濃度應在測定的工作范圍之內（配制高、中、低三種劑量水平）穩定、數量能滿足較長時間使用2021/9/1331（六）數據處理與分析方法的有效性評估評估的內容特異性靈敏度精密度準確性健全性穩定性非特異結合最大結合2021/9/1332三、幾種典型放射免疫分析試劑盒的制備（一）甲狀腺素放射免疫分析試劑盒的制備（二）游離甲狀腺素FT4試劑盒的制備（三）人血清促甲狀腺激素免疫放射分析試劑盒的制備2021/9/1333四、免疫分析技術進展國際市場市場規模接近300億美元，近期每年

15、增長率在7-9%左右。特點 檢測品種多，達近千種，并且還在持續增加； 同一公司有多個產品技術平臺；多種免疫分析方法并存，相互競爭，相互補充； 大公司產品系列全，小公司產品有特色； 高度集成、自動化的儀器診斷與簡單、快速便于普及的快速診斷。2021/9/1334國 內 200余廠家； 北京北方生物技術研究所 濰坊三維生物工程集團有限公司 北京科美東雅生物技術有限公司 原子高科股份有限公司 100余種系列產品； 市場規模40億元（國內與國外各占一半）； 年增長率10-16%；2021/9/1335面臨的挑戰 酶免疫分析 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 時間分辨熒光免疫分析 (Time-resolved Fluoroimmunoassay, TRF) 化學發光免疫分析 (Chemiluminesent immunoassay, CLIA）2021/9/1336放射免疫分析和非放射免疫分析技術性能比較種類RIAELISATRFIACLIA示蹤