1、流式細胞儀分析課件流式細胞儀分析課件第一節 流式細胞儀的分析及 分選原理 流式細胞儀由液流系統、光學與信號轉換測試系統和信號處理及放大的計算機系統三大基本結構組成。 流式細胞術所具有的分析和分選功能主要涉及光學原理、光電轉換原理和測試原理三部分。2022/9/112檢驗本科第一節 流式細胞儀的分析及 一、工作原理 基本組成結構1、液流系統：由樣本和鞘液組成。樣本：待測細胞被制備成單個細胞的懸液后經熒光染料標記的單克隆抗體染色；鞘液：是輔助樣本流被正常檢測的基質液。作用（圖4）2022/9/113檢驗本科一、工作原理 基本組成結構1、液流系統：由樣本和鞘液組2、光學系統：由激光光源、分光鏡、光束

2、成形器、透鏡組和光電倍增管組成。 激光光源：多為氣冷式氬離子激光器，其激光束波長為488nm，15mW。 分色反光鏡：反射較長波長的光，通過較短波長的光。 光束成形器：將激光器發射的激光束聚焦成高15m、寬57m的橢圓光斑。 2022/9/114檢驗本科2、光學系統：由激光光源、分光鏡、光束成形器、透鏡組和光電倍 透鏡組：將激光和熒光變成平行光，同時除去離散的室內光。 濾片：長通濾片一允許長于設定波長的光通過；短通濾片一允許短于設定波長的光通過；帶通濾片一允許一定帶寬波長的光通過，其他波長的光不能通過。 光電倍增管：檢測熒光和散射光，同時將光學信號轉換成電脈沖（數字數據）信號。（圖13）202

3、2/9/115檢驗本科 透鏡組：將激光和熒光變成平行光，同時除去離散的室內光。23、數據處理系統： 主要由計算機及其軟件組成。2022/9/116檢驗本科3、數據處理系統：2022/9/98檢驗本科 基本工作原理 標志了特異性熒光染料的單細胞懸液經噴嘴高速射下，與水平方向的高度聚焦的激光束垂直相交，單個細胞上標記的熒光染料在通過激光光斑時被激發而產生特異性熒光，同時，由于混合細胞群中細胞大小和胞內顆粒的多少會被激發而產生不同的散射光。在入射光束與液柱垂直的方向有熒光檢測系統和散射光感受系統，用于收集熒光信號和側向散射光信號，前向散射光感受器在前向小角探測接受前向光信號。2022/9/117檢驗

4、本科 基本工作原理 標志了特異性熒光染料的單細胞被接收的光電信號被光電倍增管轉換成電壓脈沖和積分脈沖，使信號放大，該信號進入計算機系統進行數據轉換、儲存、分析、處理，按不同的檢測設計采用相應軟件程序對結果進行綜合分析，并以圖像和數據顯示于熒光屏上。 流式細胞儀產生分析的電信號主要是光散射信號和熒光信號，流式細胞儀依據細胞流經光照射區時電壓訊號的強弱來分析和分選細胞。（圖5）（圖10）2022/9/118檢驗本科被接收的光電信號被光電倍增管轉換成電壓脈沖和積分脈沖，使信號二、散射光的測定 細胞對光的散射是細胞在未遭受任何破壞情況下固有的特性。2022/9/119檢驗本科二、散射光的測定 細胞對光

5、的散射是細胞在未遭 前向散射光（FS） 由激光束前方的FS檢測器收集，FS信號的強弱與細胞的體積大小成正比，用于檢測細胞或其他粒子物質的表面屬性。（圖11） （圖6）2022/9/1110檢驗本科 前向散射光（FS） 由激光束前方的FS檢測 側向散射光（SS） 由激光束垂直方向的側向檢測器收集，SS信號的強弱與細胞或其他顆粒的大小。形狀及粒度成正比。SS用于檢測細胞內部結構屬性，可獲得有關細胞內超微結構和顆粒性質的參數。（圖12） （圖7）2022/9/1111檢驗本科 側向散射光（SS） 由激光束垂直方向的側向三、熒光測量 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發后產生，每種熒光染

6、料都有特定的激發波長，激發后又會產生特定波長熒光和顏色，通過濾光片，將不同波長的散射光，熒光信號區分并送到不同的光電倍增管，經過一系列信號轉換、放大、數字化處理，就可以在計算機上直觀地統計染上各種熒光染料的細胞百分率。2022/9/1112檢驗本科三、熒光測量 熒光信號由被檢細胞上標記的特異性 選擇不同的單克隆抗體及熒光染料就可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個不同特征。 流式細胞儀的檢測原理中最重要的一點就是檢測熒光的特定發射波長。2022/9/1113檢驗本科 選擇不同的單克隆抗體及熒光染料就可以利用流 光信號測量 線性放大器用于測量信號強度變化范圍較少或代表生物學線性過程的信號。

7、對數放大器用于測量信號強度變化范圍大且光譜信號較復雜的信號。（圖13） 流式細胞儀中最常用于單抗標記的熒光染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。2022/9/1114檢驗本科 光信號測量2022/9/916檢驗本科 熒光補償（圖8） 通常用熒光補償的方法來消除重疊信號，保證檢測信號的正確性。2022/9/1115檢驗本科 熒光補償2022/9/917檢驗本科四、細胞分選原理 基本原理 當細胞懸液形成液流柱經流動室，通過機械振動使液流柱斷裂成一連串均勻的液滴，當實驗設計中設定了被分選細胞的特性參數時，此類細胞在形成液滴時會被充電，使其帶有正電荷或負電荷，帶電荷的液滴在落入電極偏轉板的高壓靜電

8、場，依所帶電荷是正或是負而發生向右或向左道偏轉，落人指定的收集器中，完成細胞分選的目的。 （圖14） （圖9）2022/9/1116檢驗本科四、細胞分選原理 基本原理 當細胞懸液形 技術要求1、分選速度：至少5000個/秒，與分選細胞在懸液中的含量有關。2、分選純度：除與儀器的精密度相關外，還與被分選細胞與其他細胞有無相互重疊相關。2022/9/1117檢驗本科 技術要求1、分選速度：至少5000個/秒，與分選細胞在懸3、分選收獲率：指設定通過測量點的分選細胞與實際收獲的分選細胞之間的比率。與被分選細胞與其他細胞有無相互重疊相關，還與純度有關，純度收獲率。4、分選得率：是指從一群體細胞懸液中分

9、辨出的目的細胞總量，再經分選后獲得的目的細胞實際比率。與分選速度相關，分選速度分選得率。2022/9/1118檢驗本科3、分選收獲率：指設定通過測量點的分選細胞與實際收獲的分選細第二節 數據的顯示與分析略！2022/9/1119檢驗本科第二節 數據的顯示與分析略！2022/9/921檢驗第三節 流式細胞儀免疫 分析的技術要求一、免疫檢測樣品制備 制備單細胞懸液是最關鍵的第一步。 外周血淋巴細胞樣品的制備 單個核細胞的分離制備，最常用單次密度梯度離心法2022/9/1120檢驗本科第三節 流式細胞儀免疫 培養細胞的樣品制備 新鮮實體組織單細胞懸液的制備 常用方法有機械法、酶處理法、化學試劑處理法

10、和表面活性劑處理法。 單細胞懸液的保存1、深低溫保存法2、乙醇或甲醇保存法3、甲醛或多聚甲醛保存法2022/9/1121檢驗本科 培養細胞的樣品制備2022/9/923檢驗本科二、免疫分析中常用的 熒光染料與標記染色 常用的熒光染料熒光染料需具備條件：1、有較高的量子產額和消光系數；2、對488nm的激發光波長有較強的吸收；3、發射光波長與激發光波長之間有較大的波長差；4、不影響結合抗體自身的特異性。2022/9/1122檢驗本科二、免疫分析中常用的 常用熒光染料：1、異硫氰酸熒光素（FITC）：最常用，發亮綠色熒光，但發射熒光強度易受PH值影響。2、羅丹明：發紅色熒光，缺點是不易溶于水。3、

11、藻膽蛋白類：發橙色至紅色熒光，最常用的是藻紅蛋白（PE）。2022/9/1123檢驗本科常用熒光染料：2022/9/925檢驗本科 免疫熒光標記熒光染料與細胞成分結合的方式：1、結構親和式：以電力結合，為帶正電荷的熒光分子與帶負電荷的核酸分子磷酸基團相互吸引2、嵌入結合方式：光分子直接嵌入核酸堿基對中。3、共價鍵結合方式：細胞DNA鍵的連接之間以原子結合方式展開，熒光分子與其形成共價結合方式。2022/9/1124檢驗本科 免疫熒光標記熒光染料與細胞成分結合的方式：2022/9/4、熒光標記抗體特異性結合方式：熒光分子與單克隆抗體的F（ab）2片段氨基發生化學反應而形成熒光標記基團。 前三種染

12、色方式常用于細胞內成分的染色分析，第四種方式為流式免疫熒光分析所常用。 直接免疫熒光染色法 間接免疫熒光染色法 雙參數或多參數分析時熒光抗體的組合技術2022/9/1125檢驗本科4、熒光標記抗體特異性結合方式：熒光分子與單克隆抗體的F（a 細胞自發熒光 大部分哺乳動物細胞內的吡啶或黃素類核苷酸都存在自發熒光，用紫外光或藍光激發可藍色或綠色熒光。 在免疫檢測中，淋巴細胞的自發熒光強度易引起信號干擾，出現假陽性結果，特別是在用FITC標記染色時。2022/9/1126檢驗本科 細胞自發熒光 大部分哺乳動物細胞內的吡啶或三、流式細胞免疫學技術的質量控制 單細胞懸液制備的質量控制1、采用適當的制備方

13、式2、溫度與PH2022/9/1127檢驗本科三、流式細胞免疫學技術的質量控制 單細胞懸液制備的質量 細胞懸液免疫熒光染色的質量控制1、溫度對熒光染色的影響2、PH對熒光發射強度的影響3、熒光染料濃度的控制4、固定劑對免疫熒光染色的影響2022/9/1128檢驗本科 細胞懸液免疫熒光染色的質量控制1、溫度對熒光染色的影響2 儀器操作技術的質量控制1、光路與流路校正2、PMT校準3、絕對計數的校準2022/9/1129檢驗本科 儀器操作技術的質量控制1、光路與流路校正2022/9/9 免疫檢測的質量控制1、同型對照：為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組織來源不同，應選用相同來源的未標

14、記單抗作為同型對照來調整及設置電流電壓，在此基礎上進行樣本檢測可使熒光標記單抗的信號保持特異性，如不用同型對照，結果的可靠性將受到影響。2022/9/1130檢驗本科 免疫檢測的質量控制1、同型對照：為免疫熒光標記中的陰性對2、全程質控 質控物Immuno-Trol Cells是全血質控的凍干品，將其復溶后與待檢標本一起標記、洗滌和檢測，所得結果如達標定靶值，提示本次實驗結果可靠。2022/9/1131檢驗本科2、全程質控2022/9/933檢驗本科第四節 流式細胞術在免疫學 檢查中的應用一、淋巴細胞及其亞群的分析二、淋巴細胞功能分析三、淋巴造血系統分化抗原及白血病免疫分型四、腫瘤耐藥基因分析

15、五、在AIDS病檢測中的分析六、自身免疫性疾病相關HLA抗原分析2022/9/1132檢驗本科第四節 流式細胞術在免疫學 掌握： 流式細胞儀的工作原理； 流式細胞儀的技術要點熟悉：流式細胞術在免疫學檢查中的應用了解：流式細胞儀的數據顯示與分析2022/9/1133檢驗本科掌握： 流式細胞儀的工作原理；2022/9/935檢驗本科圖1 流式細胞儀2022/9/1134檢驗本科圖1 流式細胞儀2022/9/936檢驗本科圖2 流式細胞儀2022/9/1135檢驗本科圖2 流式細胞儀2022/9/937檢驗本科圖3 流式細胞儀2022/9/1136檢驗本科圖3 流式細胞儀2022/9/938檢驗本科

16、圖4 流式細胞流動池模擬圖前向散射光鞘液噴嘴側向熒光信號2022/9/1137檢驗本科圖4 流式細胞流動池模擬圖前向散射光鞘液噴嘴側向熒光圖5 FCM工作原理流程圖鞘液分光鏡紅色熒光綠色熒光90散射光前向散射光激光器細胞收集管細胞懸液電荷環偏轉板廢液2022/9/1138檢驗本科圖5 FCM工作原理流程圖鞘液分光鏡紅色熒光綠色熒光圖6 前向散射光示意圖大顆粒小顆粒激光器激光器激光探測器2022/9/1139檢驗本科圖6 前向散射光示意圖大顆粒小顆粒激光器激光器激光探復雜性顆粒簡單性顆粒側向散射光探測器激光器激光器圖7 側向散射光示意圖2022/9/1140檢驗本科復雜性顆粒簡單性顆粒側向散射光

17、探測器激光器激光器圖7 圖8 4色熒光峰形線圖FITC RD1 ECD PC5熒光波長（nm）熒光強度2022/9/1141檢驗本科圖8 4色熒光峰形線圖FITC 圖9 細胞分選原理3、細胞分選2、細胞膜、胞質、胞核著色1、細胞懸液4、細胞培養、研究噴嘴激光2022/9/1142檢驗本科圖9 細胞分選原理3、細胞分選2、細胞膜、胞質、胞核圖10 流式細胞儀工作原理噴嘴壓電晶體分色反光鏡阻斷濾片偏轉板廢液抽吸前向散射光檢測器激光器樣品鞘液液滴形成信號液滴充電信號F1 PMTF2 PMTF1F2散射2022/9/1143檢驗本科圖10 流式細胞儀工作原理噴嘴壓電晶體分色反光鏡阻斷濾片圖11 前向散射原理圖2022/9/1144