1、生命科學學院生物化學第二章 蛋白質第一節 蛋白質的概念及其生物學意義一、什么是蛋白質？AA 借肽鍵相連形成的高分子化合物（短桿菌肽含 D-苯丙氨酸）O肽鍵： CNH 也叫酰胺鍵二、蛋白質的生物學作用（或稱功能分類）物質吸收與運輸、運動，調節代謝、儲存養分、催化各種生化反應、分子間的識別（支架蛋白）、信息傳遞（受體 復制酶）、記憶、疾病防御 抗體。應用：固體酶的工業應用（聯于水不溶性樹脂上） 、脫（紡織品）漿（淀粉酶） 、生化制藥， 蛋白酶用于皮革的脫毛及軟化等，都是利用蛋白質的催化作用，蛋白質生物芯片（貯存信息量大，將多種蛋白質抗體固定、排列到玻璃板上，能檢測各種疾病蛋白及其他基因表達蛋白）

2、，進行病原體與疾病診斷等。第二節 蛋白質的組成一、蛋白質的元素組成：C（50-55）、H（6-8）、O（20-30%）、N（15-18）、S（半胱 aa）（0-4%）有的還含有 P（酪蛋白 ）、Fe、Zn、Mo（鉬 Fe 蛋白）、Cu、I，特別是含 N 量都很接近，平均為 16% 。所以，測出含 N 量 6.25（100/16 蛋白質系數）即可推測出蛋白質的含量凱氏定氮。二、蛋白質的 aa組成通常只有 20種，除Pro 外均為 aa ，除甘氨酸外， 都有 D、L 兩種異構體（碳原子為不對稱碳原子）所以有旋光性。投影式如下：COOH COOHH2N C H H C NH2R RL D aa的分類

3、方法：（一）氨基酸的種類分類一 根據側鏈基團 R 的化學結構分為四類：第一類 脂肪族 aa：側鏈是脂肪烴鏈一氨基一羧基（中性） ：一氨基一羧基 aa中共九種： CH2 CH COOH CH COOH CH2 CH COONH 2 OH NH+3 SH NH+3(Gly : G) (Ser:S ) (Cys:C )CH3 CH COOCH3 CH CH COOCH3 CH CH COONH+3 OH NH+3 CH3 NH+3(Ala :A ) (Thr :T ) (Val :V 支鏈 aa)第1頁 共 132 頁生命科學學院生物化學CH3 S CH2 CH2 CH C?OCH3 CH CH2

4、CH ?O?(Met :M) NH+3 CH3 NH+3(Leu: L 支鏈aa) CH3 CH2 CH CH COOCH3 NH+3(Ile :I 支鏈aa)一氨基二羧基 aa(酸性 )及其酰胺 OOC CH2 CH COOOOC CH2 CH2 CH COONH+3 NH+3(Asp :D ) (Glu :E )O OH2N C CH2 CH COOH2N C CH2 CH2 CH COONH+3 NH+3(Asn :N ) (Gln :Q)二氨基一羧基 aa（堿性： NH2-COOH）+H3N CH2（CH2）3 CH COOH2N C NH （ CH2）3 CH COO + NH2+

5、NH 3+NH 3（Lys:K） (Arg :R)第二類芳香族 aa（含有苯環的化合物叫做芳香族化合物，有的包括Trp）： CH2 CH COOHO CH2 CH COONH+3 NH+3(Phe:F ) （丙 aa取代） (Tyr :Y )第三類雜環 aa： CH2 CH COO HC C CH 2 CH COOHN+ NH NH +3 N NH +3CH（His:H 咪唑基） (Trp :W 吲哚基 苯并吡咯 )第四類脯氨酸，也稱雜環亞氨基酸：由Glu 還原、環化、再還原形成 COO四氫吡咯 -2- 羧酸+NH 2第2頁共 132 頁生命科學學院生物化學(Pro:P )分類二 按側鏈 R

6、基團的極性（及在 pH7 左右時的解離狀態）分為：非極性：甘、丙、纈、亮、異亮、苯丙、蛋、脯、色氨酸。不帶電荷：帶 OH、SH、酰胺基極性 帶負電荷（酸性 aa）帶正電荷： Lys、Arg、His (堿性 aa) . His等電點為 7.59 此外在蛋白質代謝中還有鳥 aa、瓜 aa（尿素循環中）、胱 aa、羥脯 aa、羥賴 aa （膠原蛋白的組分） 。甘 aa的H 介于極性與非極性之間， 有時歸入極性不帶電荷類中。人和動物的必需 aa：不能自身合成必須由食物獲得。 Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp、His* 、Arg* (* 半必需 aa，兒童合成不足)（二）a

7、a的性質1. 物理性質：無色結晶，易容于水，不容于有機溶劑，熔點高（ Gly：232, 乙酸：16.6，分子間靠氫鍵締合） ，這些特性說明是離子化合物。2. 兩性解離及等電點： （難點*）+帶負電，加 H+結合 H+帶正電，向陰極移動，加堿解離出 H COO在某一 pH 下帶正、負電荷量相等。+ C H （由很酸向堿變化 NH+3 CH COOH NH+3 CH COOH3N）R R R在電場中不移動，此時的 pH 稱為 aa的等電點（ pI）。此時 aa的溶解度最小（因為靜電作用），pI 與COOH 和NH2 的解離常數有關。K1：COOH 解離為 COO+ H+的解離常數； K2：H3N+

8、解離為 NH2 + H +的解離常數。其 pI 可從 pK 計算或測定 (用酸堿滴定法測定 )。aa 等電點的計算：只有一個解離基團的物質 AH，其解離常數與 pH 的關系為 pH=pK+lg(A-/AH).證明：+ K=A -* H +/AH H+=K*AH/ A -=K/ （A-/AH ） AH A+=-lgk-lg （A -/AH ） 即：pH=pK+lg （A-/AH ）Henderson-方程。當 -lg H -=AH 時，pH=pK，即溶液的 pH 可由其溶質的解離常數有一半解離時，即 A與解離量計算而得，溶質的解離常數可查得。+pK：解離常數 K 的負對數。aa可看作二元弱酸（酸

9、性條件）有兩個可解離的 H其分步離解如下： K 1（+OH ）+ + H 在充分酸的條件下 RCHCOOH RCHCOO+NH 3 NH+3 +） （R0）（RK 2 RCHCOO + HRCHCOO+第3頁 共 132 頁生命科學學院生物化學NH+3 NH 2 0） （R（R）R 0 + 0H +0H +R H += KR1=+R 0 +K1 R =R時 K1=H+0 RK 2= R =0 = R 0時 K2 = H+ + 用 NaOH 滴定到 RR H等電點時 ：aa 處于兩性離子狀態，可有少量解離成陽離子和陰離子，但解離成陽離子和陰離子的數目和趨勢相等。即： + 0 + 0 + + 2R

10、 =R 即 R H / K 1=K 2R / H H = K 1* K 2+ 2=K 1 ?K2 lgH +=pH ；lgK 1=pK 1； lgK2=pK 2 H +lg K1lgK2 即：兩邊取負對數得 2 lgHpH= pK 1 + pK2 / 2 = pI分子的存在狀態是多種多樣的，但在一定條件下以某一狀態為主。 0)兩側的 pK 值的平均值。基團的 pK 值可查得，即 aa的等電點 pI 就是兩性離子 (R故 pI 值可由二 pK 值計算得之。對于有三個解離基團的 aa，如Asp、Lys 只要取其兼 (兩)性離子兩側的 pK 值的平均值即得 pI 值。 COOH COO COOCH

11、NH+3 K 1 CH NH+3 K2 CH NH+ =3 K3 AspCH2 CH2 CH2COOH COOH COOAsp+(R+) Asp0(R0) Asp（R）0+)與（R等電點時 Asp 主要以兼性離子 R 存在，(R）很小且相等（等電狀態為理想狀態， pI 為理論值）。pI=（pK1+pK2）/ 2 同上賴 COOH COOCOO COOCHNH+3 K1 CHNH+3 K2 CHNH 2 K3 CHNH2（CH2）4 （CH2）4 （CH2）4 （CH2）4NH+3 NH+3 NH+3 NH2 2+） （R+） （R0） （R（R） 2+可忽略不計（ pI 時可認為它是不存在的，

12、否則就不是pI=（Pk2+pK3）/ 2 因 R+等電狀態了）。 NH2 比 NH2 堿性強，結合 H能力大，結合后不易放出第4頁 共 132 頁生命科學學院生物化學+H （因受 COOH 影響小）。3. 氨基酸的化學性質：與強酸、強堿都可生成鹽（銨鹽與羧酸鹽）如 谷氨酸鈉與水合茚三酮的反應 80-100的條件下，首先使 aa氧化脫羧脫氨形成醛，而本身被還原成還原型茚三酮， 然后還原型茚三酮、 氨和另一分子的水合茚三酮縮合形成藍紫色的二酮茚二酮茚胺， 這是 aa 定性定量測定的基礎， 反應如下O OHHO3H2O+ NH3 + HOOHO OHOOO O NNHO OO O（二酮茚 -二酮茚胺

13、 紫蘭色 吸收峰 570nm ）Pro、羥 Pro 生成黃色物質 (因為無氨基 ) 用于比色、測定、層析、電泳的顯色劑。因為產生 CO2 ，也可用 CO2 氣體分析法測定 aa（只限于 -氨基酸 ），肽和蛋白也有此反應，肽越大靈敏度越差 。+NH3N 被氧化成 N2，HNO2 與亞硝酸的反應 （aa的 NH2 基被氧化成 OH），N 被還原為 N2，等量進行。所以 N2 一半來自 HNO2（其他伯氨基均可） 。生成 N2 的反應叫 van slyke（X斯萊克）反應。可測 N2 量（體積）計算氨基的含量。用于測定蛋白質的水解程度。 與甲醛的反應： 酸堿滴定沒有適宜的指示劑（因為等當點過高或過低

14、） 。其氨+基可與甲醛反應（加成） ，生成 N羥甲基或 N，N二羥甲基 aa。使 NH3 變為 +。使溶液酸性增強，可用 NaOH 滴定之。與 NH2 的含量相當，即NH2 釋放出 H+被中和時的 pH 為終點）。 aa含量。這就是 aa的甲醛滴定法，（滴定到放出的 HRCHCOO RCHCOO+NH 3 NH 2 +H+HCHO RCHCOONHCH 2OH+HCHORCHCOO第5頁 共 132 頁生命科學學院生物化學N(CH 2OH) 2與 2，4二硝基氟苯的反應（胺與鹵代烷的反應） NH3 的烷基化，生成黃色 DNPaa，不被酸水解。 也可用之測肽和蛋白質的 N端 aa，反應后酸解得

15、N端的 DNPaa，有機溶劑提取分離，層析與標準氨基酸對比即可鑒定之。O2N FNO 2H3CNCH3O=S=OClDNFB 丹磺酰氯Sanger試劑 （5二甲氨基萘磺酰氯）O2N FR H R+ H2NCHCOOH CHCOOHO2N NNO 2NO2因為丹磺酰 aa 有強烈的熒光，所以可用熒光光度計測定。 （均在試劑與NH2 之間脫去鹵化氫）均稱 Sangar反應。DNFB 亦可與非 氨基反應 ,如可生成：DNP-鳥氨酸。與異硫氰酸苯酯（ PITC）的反應，稱艾德曼反應（ Edman）反應：弱堿性條件下，形成苯氨基硫甲酰 aa(PTC aa)，在無水酸（硝基甲苯中與酸作用）環化ON=C=S

16、NH CNH CHCOOHN C+aaS RC CHS R NH為苯乙內酰硫脲氨基酸（簡稱 PTH 或 PTH-氨基酸）。PTH 在無水酸中極穩定。PTC 基的引入使緊接著的肽鍵減弱，所以在無水酸中只切下之（環化斷裂同時發生） PTHaa在紫外區有強吸收。Vmax=268nm.PTHaa可用各種層析技術分離，紫外分析測定與標準 PTHaa 對比即可知為何種 aa（N 末端），多肽、蛋白 的 N 末端 aa也可與 PITC 反應，不斷重復可得蛋白質 aa 順序，多肽的 aa順 序自動分析儀，即以此原理設計而成。一次可測 60 多個 aa。7. 成肽反應：肽即氨基酸脫水縮合而成的化合物RCHCOO

17、H + H 2NCHCOOH RCHCONH CHCOOHNH 2 R NH2 R 二肽、三肽 , 含一個自由的 氨基與羧基，還可縮合為多肽蛋白質第6頁 共 132 頁生命科學學院生物化學活性肽：谷胱甘肽 GSH *Glu 的 r 羧基Cys 的氨基縮合成 r 肽鍵：SHCOOH O CH 2 O HCH （CH2）2 C NH CH C NH C COOHNH 2 2H HGSSG（氧化還原酶的輔酶 SH）催產素與加壓素（激素類） ：前者使子宮與乳腺平滑肌收縮二者只有兩個 aa 不同： 3Ile 3Phe 8Leu 8Arg所以有催產和促排乳作用， 后者則使血管平滑肌收縮使血壓升高 （也使腎

18、小球血管收縮形成尿減少）（也是血壓升高的原因之一） 。所以也叫抗利尿激素， 也與學習的記憶過程有關。 均由下丘腦合成，神經垂體分泌入血9 肽67 8 9+H3N S CysSTyrCysPhe Asn GlnOPro Arg GlyCNH2升壓素腦 啡 肽： 許 多有 鎮 痛作 用 ： C 端 Leu（ Leu 腦啡肽已人工合成）C 端 Met似嗎啡有鎮痛作用但不上癮 （5 肽）TyrGlyGlyPheMet促腎上腺皮質激素（ ACTH 39 肽，腦垂體分泌）、膽囊收縮素（ 33 肽，十二指腸分泌） 括約肌收縮，膽汁分泌減少引起厭食 (減肥 )胰高血糖素 (29 肽，胰島 -細胞分泌)使糖原降

19、解， 血糖升高， 與胰島素相反。8 與熒光胺反應（ 氨基）：產物具有熒光R OON CHCOOH + CO 2HO +aaOOO熒光胺 熒光產物（被 390nm 光激發，發射 475nm 的熒光） ng 級 /雙硫基雙（ 2硝基苯甲酸）反應9. 與5，5測半胱 aa（Cys）等的游離 SH 含量，生成含SH 的硝基苯甲酸產物 OD412nm有一吸收峰可測之 Cys 的含量。CH2 CH COOHOOCNO2NO2 NO2COOH COOHSH NH+3 +CysS S SH /雙硫基雙（ 2硝基苯甲酸） 硫代硝基苯甲酸5， 5Cys 與抗性有關 (吸收峰 412nm)第7頁 共 132 頁生命

20、科學學院生物化學（三）aa制備與分析 （可略）+） 胱 aa、半胱氨酸 制備： 蛋白水解：毛發水解（ H發酵：Glu 菌發酵 Glu 鈉化學合成： 酮酸 + NH3 aa分 離：層析與電泳第三節 蛋白質的結構蛋白質多肽鏈可分為四級結構。一、蛋白質的一級結構： 其 aa種類、連接方式及排列順序， 包括二硫鍵 (共價鍵)。H2NCHCONH CHCONH CHCO, NHCHCOOHR1 R2 R3 RnNH CHCO（稱為 aa 殘基） R書寫： N 端(氨基末端)：有 氨基的一端寫在左邊用 H 表示C 端(羧基末端 )：有 羧基的一端寫在右邊用 OH 表示成環則無連接方式： CONH。SS與穩

21、定肽鏈的空間結構和生物活性有關如胰島素： 51aa（分子質量 5734）21A+30B20 217 OHHH611OH 7 19研究方法：測定蛋白質的 aa序列。Edman法一次只能測定 60-70 個 aa殘基的肽段 單條肽鏈測定如下：1.測定 aa組成。酸解、堿解，可避免多肽鏈的 aa丟失。（測分子量確定 aa 個數 氨基酸殘基的平均分子量為 120 ）2.測 N、C 末端 aa 。DNFB 法等，確定肽鏈的數目，（羧肽酶 A 釋放除 Pro、Arg 和 Lys 的所有 C 末端殘基，羧肽酶 B 只水解 Arg 和 Lys 為 C 末端殘基的肽鍵，二者合用）3.用兩種以上的方法將蛋白質斷裂

22、為不同的肽段。如用不同的酶水解。4.分離各肽段，并測出它們的序列。 Edman法 5.根據各肽段的重疊部分推出蛋白質的全部 aa排序。也可 DNA 測序后反推。 關鍵是小肽段 aa順序的測定： Edman反應（降解法） 與外肽酶酶解法。 如：某十肽，用胰凝乳蛋白酶酶解得 4 個小肽：A1:Ala Phe；A2:Gly LysAsnTyr ；A3:ArgTyr ；A4:His Val胰蛋白酶酶解得 3 個小肽：B1:Ala PheGlyLys；B2:Asn Tyr ArgB3:Tyr His Val.根據重疊結構拼接為：Ala PheGlyLysAsnTyr ArgTyr His Val( 可直

23、接 Edman法)第8頁 共 132 頁生命科學學院生物化學如果含兩條以上的肽鏈先拆分成單鏈，若含二硫鍵需先拆開：過甲酸氧化形 成二個半胱氨磺酸 ( 或用 - 巰基乙醇還原后用碘乙酸保護 - 形成羧甲基衍生物 ) ：HCOOOH-CH2-S-S-CH2- -CH 2-SO3H + -CH2-SO3H含SO3H，分析時即知 SS的位置（可先水解成只含一個或少量 SS的小肽段，以便確定 SS的準確連接位置） 。二硫鍵位置的確定（另取一份樣品）+ -+ 熏蒸一般用蛋白酶水解帶有二硫鍵的蛋白質， 從部分水解產物中分離出含二硫鍵的肽段，再拆開二硫鍵，將兩個肽段分別測序，再與整個多肽鏈比較，即可確定二硫鍵

24、的位置。常用胃蛋白酶，因其專一性低，生成的肽段小，容易分離和鑒定，而且可在酸性條件下作用（ pH2），此時二硫鍵穩定。肽段的分離可用對角線電泳，將混合物點到濾紙的中央， 在 pH6.5 進行第一次電泳， 然后用過甲酸蒸汽斷裂二硫鍵，使含二硫鍵的肽段變成一對含半胱氨磺酸的肽段。將濾紙旋轉 90 度后在相同條件下進行第二次電泳，多數肽段遷移率不變，處于對角線上， 而含半胱氨磺酸的肽段因負電荷增加而偏離對角線。用茚三酮顯色，分離，測序，與多肽鏈比較，即可確定二硫鍵位置。提取DNA測序后反推蛋白： 蛋白質抗體 蛋白 mRNA 反轉錄 cDNA 測序反推（見后一章）。第三節 蛋白質的結構多肽鏈可分為四級

25、結構。一、蛋白質的一級結構： 其 aa種類、(共價)連接方式及排列順序， 應包括二硫鍵 。二、蛋白質的空間結構多肽鏈按一定方式盤繞折疊， 形成立體（空間）結構（各基團的作用力之故） 。也稱蛋白質的構象（或高級結構） ：指蛋白質分子中所有原子在空間的排列及肽鏈的走向，以一級結構為基礎。第9頁 共 132 頁生命科學學院生物化學肽鍵及肽鍵平面，雙鍵性質（不能自由旋轉且比一般 C-N 鍵短，比 C=N 鍵長）O O O CCCNCCNC C=N O與H成反式H H C H亞氨基肽鍵中的 4 個原子CONH（羧基與另一 aa 的氨基構成）和與之相連的兩個 C原子都處于同一平面上。這個平面叫肽鍵平面，

26、有部分單鍵的性質，只有 C ，C 鍵可以旋轉。 多肽的主鏈由許多肽鍵平面構成，平面可以 C 為頂點繞 NC和 CC鍵旋轉，但受側鏈基團的影響，只有少數的特定結構。所以肽鏈折疊有一定的限制，分為二、過渡、三、四級結構。1. Pr 的二級結構：指多肽鏈本身的折疊與盤繞方式，驅使蛋白質折疊的主要動力來自各側鏈基團及其與介質的相互作用（ H 鍵維持系統的能量平衡） 。主要有 螺旋結構、 折疊、 轉角、無規則卷曲四種。1） 螺旋結構：毛、發、羽毛中的 角蛋白中的主要形式，多肽鏈盤繞成右手或左手螺旋（是由肽鍵平面繞 C 相繼旋轉一定的角度形成的） 。典型的右手N3.6aa 殘基為一圈，高 0.54nm 0

27、.54/3.6=0.15nm ，360 0/3.6=1000/3.6=1000側鏈 R 基伸向螺旋外側相鄰螺旋圈 C=O 與亞氨基（ NH）氫間形成鏈內 H鍵，每個殘基的 C=O都與它后面的第四個 aa 殘基（隔三隔 aa 殘基）形成 H 鍵，氫鍵平行中心軸。O H O H CNH C C N nS 3.613 (3 3)+4=133 Rs：形成氫鍵封閉（合）環內共價連接的原子數，幾乎全為右手螺旋（也有極少數左手螺旋）。但整條肽鏈并非全是，如有 Pro 存在時，即中斷（無 H 可形成 H鍵）。帶同電荷的 aa 出現在鄰近位置上就會影響螺旋的形成， 甘氨酸也不易形成螺旋。2） 折疊結構： O=C

28、 C N C縱向排列形成片層 N-HN N N N C N平行(角蛋白 ) 反平行 (絲心蛋白 )折疊片層也可在同一肽鏈的不同部分之間形成。 凸起： 折疊的一股彎曲使一個氨基酸殘基突出出來不形成氫鍵。第10 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學3） 轉角 出現在 180 回折角處，此處 Gly、Pro 多（側鏈小才可形成），也叫發夾結構、回折、 彎曲。O H O H CNH C C N nS 310 (3 2)+4=1024）自由回轉（無規則卷曲） ：無規則的松散結構。一種蛋白質中往往含幾種二級結構2. 超二級結構與結構域：相鄰的二級結構的組合體 （構象單元） 在空間上能與其它部分分開， 、

29、 、（靠近）、 （連接鏈連接平行的 片層）、曲折（轉角連接）、回形拓撲結構 曲折左手超螺旋 希臘鑰匙構象超二級結構無特定功能（只有一定的組合規則，在空間上能辨認） 。結構域：是球蛋白的折疊單位，超二級結構進一步盤曲折疊成球狀的，在空間上獨立（相對）的、具有部分（一定）功能的結構，較小的蛋白可能只有一個結構域， 這時結構域等于三級結構， 超二級結構與結構域在結構上很難區別 （后者比前者更復雜）。結構域的類型： 圓桶、螺旋束結構域（后二者）等3轉角78 6 25 41丙酮酸激酶 溶菌酶 肌紅蛋白三級結構 (單域)由兩個以上結構域組合成三級結構（可以是完整功能的蛋白質） 。每個結構域都有其功能， 三

30、級結構是指多肽鏈的所有原子在空間的排列與分布，如肌紅蛋白的三級結構一條多肽鏈， 非極性側鏈埋于分子內部， 極性基團分布在分子表面與水結合，所以具水溶性。有幾個結構域常常就有幾個功能區， 結構與功能的統一。兩條以上肽鏈才有四級結構：分子量大的蛋白多由幾條多肽鏈組成，它們以非共價鍵結合 成一個功能單位， 執行一個特定功能， 其中一條肽鏈就稱為該蛋白的一個亞基（ Subunit ）如血紅蛋白由 2、2亞基組成。1 2第11 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學以共價鍵連接的肽鏈不能稱為亞基，如胰島素 A、B 鏈以兩個 S S 鍵相連。四級結構：就是指亞基之間的連接及空間排列， 不包括亞基內部得空間

31、結構，亞基單獨存在無活性或活性很低， 只有聚合成四級結構， 才能有完整的生物活性。如血紅蛋白只有 2、2（141、146aa）=574 個 aa 一起才能組成完整的功能單位。膠原蛋白：左手螺旋的多肽鏈纏繞成三股右手超螺旋的原膠原蛋白分子。膠原蛋白。三、蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵（非共價鍵）一級結構由共價鍵維持：肽鍵（酰胺鍵） ，二硫鍵；空間結構由次級鍵（非共價鍵）維持：氫、鹽鍵（離子鍵） 、疏水鍵、X德華引力（包括 H鍵）。二級結構主要是 H鍵，三級結構主要是疏水力，鹽鍵、X氏力也都起著重要作用（維持 特定構象）。四、蛋白質分子結構與功能的關系 一級結構：結構決定功能，相同的功能有相同或相似

32、的結構1. 不同動物的胰島素XX小異（差異在 A鏈： 8、9、10、30 位 aa 殘基）。變化的 aa 不起決定（功能）作用；細胞色素 C（呼吸鏈的重要組分）在動物間親緣關系越近， 差異越小，人與黑猩猩的差異小于人與雞的差異。細胞色素 C的結構中與之功能密切相關的部位在各種動物中都是不變的（ 104 個 aa 組成）。2. 關鍵部位結構上的一點變化，就會引起功能的顯著變化。如：鐮刀型貧血病。只是血紅蛋白（ 2：141aa，2：146aa）的 鏈的第六位 Glu Val代替就使患者紅細胞在缺氧時成鐮刀狀，易脹破、溶血，引起頭暈、胸悶等貧血癥狀，都證明Pr 結構與功能的統一性。 構象與功能的關系

33、構象：即空間結構。指取代基團，因為單鍵旋轉所形成的不同立體結構。第12頁共 132 頁生命科學學院生物化學別構現象：構象改變功能也隨之改變的現象。血紅蛋白與 O2 的親和力是很弱的，但其一個亞基與 O2 結合后引起的構象改變，亞基間次級鍵破壞， 使其它亞基與 O2 結合力變大，結合速度變快。 氧結合曲線成 S型1 2氧 氧飽 飽和 和度 度P(o2) P(o2)肌紅蛋白的氧合曲線 血紅蛋白的氧合曲線第四節 Pr 的性質一、分子量大小：一般為 1 萬100 萬主要測定方法：1. 超離心：在一定離心力下， 分子量大沉降速度快。 可用沉降系數來表示 ( 正相關) 。沉降系數：單位離心力下的沉降速度，

34、 cm/s/(cm/s10 -13 秒）-13 秒）2) 單位（S：斯威伯格單位2. 凝膠過濾：分子篩作用。分子量越大過濾速度越快，用標準蛋白作標準曲線與之比較即可知未知蛋白分子量。3. SDS 凝膠電泳：分子量與遷移率成反比，與標準樣品比較。 （因為 SDS使各種蛋白的荷 / 質比均相同）。大多數 蛋白質 與 SDS 按 1:1.4 (W/W) 的比例結合 SDS ：十二烷基硫酸鈉二、Pr 的兩性電離與等電點Pr 也是兩性電解質：解離基團：末端的 氨基與羧基、 aa 殘基側鏈上的氨基、羧基、咪唑基、胍基、SH等。NH2 PrCOOHNH+ NH+3 H+ NH23 HPr Pr Pr COO

35、 OH COOCOOH OHpH pI pI = pH pHpI兩性離子第13 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學pI ：使 Pr 所帶的正電荷與負電荷相等，靜電荷為零的溶液 pH值。此時在電場中不移動，溶解度最小。 pI ：決定與 Protein 的 aa 組成，堿性 aa 多則 pI 大，否則小。電泳：帶電物質在電場中移動的現象叫電泳。方向：取決于所帶電荷的性質 ( 正負) （后者又取決于溶液的 pH值和蛋白質的氨基酸組成）。速度：取決于所帶電荷的多少 ( 正相關) 和分子的大小 ( 負相關) （荷質比）混合蛋白的分離：電泳自由界面電泳電泳 紙上電泳 醋酸纖維薄膜電泳區帶電泳 凝膠電泳

36、圓盤電泳平板電泳等電聚焦電泳免疫電泳在 pH8.6 的電泳緩沖液中（各蛋白最大 pI 為 6.35-7.3 ）濾紙電泳血清蛋白的電泳圖如下：清蛋白 1 2 球蛋白+ 三、Pr 的膠體性質大小：直徑 1100nm，膠體顆粒：布朗運動、丁多爾現象、電泳現象、不能透過半透膜，具吸附能力（分子大表面具電荷和非極性基團） ，可用玻璃紙、火棉膠等透析純化（去除小分子雜質） ，是生產上和實驗室常用的純化方法。穩定蛋白質溶液的因素（不聚集成大顆粒而沉淀） ：水化膜（層）與電荷 pHpI四、Pr 的沉淀反應1. 加高濃度鹽鹽析：破壞蛋白質的水膜又中和其電荷。不同蛋白質所帶電荷不同，所以，所需鹽濃度不同，可分段鹽

37、析， （NH4）2SO4 半飽和，球蛋白析出；（NH4）2SO4 飽和，清蛋白析出（分子量小 pI 低），（只要 pH 或pI 可以認為所有的分子均帶同樣的電荷，所以，在一定 pH下的鹽析與分子量有關：越大越易沉淀， pI 過低或過高中和其電荷所需鹽濃度高） 。2. 有機溶劑沉淀： 極性有機溶劑與水的作用大于蛋白，破壞水膜，多同時調節 pH 使其接近pI(pI 時消除了靜電斥力 ) 。多用乙醇。3. 重金屬鹽沉淀 (pH 高于 pI 時) ：蛋白質的重金屬鹽溶解度很小 。 沉淀4. 某些酸如：單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等生成不溶性鹽而沉淀（ pHpI ），并破壞分子內氫鍵，使疏水性氨基酸殘基移至

38、分子表面，各分子靠疏水力結合。5. 加熱變性沉淀：破壞分子內氫鍵，疏水基團外露，與水親和力減弱，水溶性降低，水化膜破壞。如制豆腐：加熱大豆蛋白的濃溶液，并加入 MgCl2（鹽第14 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學鹵）使蛋白凝固。制取蛋白并保持其生物活性：鹽析、低溫下加有機溶劑沉淀，有機溶劑在高溫或長時間接觸會使蛋白質變性。五、蛋白質的變性：理化因素影響，使空間（次級）結構，理化性質和生物學性質改變 ( 但一級結構并未破壞 ) 的現象。變性蛋白質的特點：卷曲的肽鏈 伸展，構象破壞；生物功能喪失：酶的催化能力、血紅蛋白的運 O2 能力、胰島素調節血糖的功能。溶解度降低、 喪失結晶能力。因肽

39、鏈松散，易被蛋白酶消化。變性因素：化學變性因素：強酸、強堿與尿素、胍鹽、乙醇、重金屬。物理變性因素：超聲波、紫外線、加熱、震蕩與攪拌。變性的本質：次級結構破壞，但一級結構沒破壞，所以分子量和組成不變。可逆或不可逆，胃蛋白酶的升溫 (80-90 ) 與降溫(37) 可使活性可逆變化。應用：制作豆腐、尿蛋白檢驗 ( 加熱) 、急救重金屬中毒病人 ( 給中毒病人吃大量乳品、濃豆漿或蛋清，然后催吐 ) 等。制備蛋白與酶應防變性：應用低溫等。六、蛋白質的顏色反應（分析測定的依據）1. 雙縮脲反應（要求含兩個以上肽鍵）在堿性條件下能與 CuSO4 反應生成紅紫色的絡合物，具有雙縮脲結構的物質+都有此反應（

40、二脲加熱脫氨形成雙縮脲： H2NCNHCNH2）與 Cu離子（兩側的氨基） ，540nm有吸收峰。O O形成絡合O OCNHCHCNH ：含兩個肽鍵的結構與雙縮尿相似。2. 米倫（氏）反應：米倫試劑：硝酸、硝酸汞、亞硝酸與亞硝酸汞的混合液（ millon,reaction/反應）與蛋白質相遇產生白色沉淀 ( 加熱后則呈磚紅色 ) ，酪 aa 等含酚基化合物都有此反應。3. 乙醛酸的反應（ Trp）將濃 H2SO4 加入蛋白質與乙醛酸的混合液， H2SO4 與混合液成兩層，兩層間出現紫色環，為 Trp 與乙醛酸的縮合物，不含 Trp 的白明膠無此反應。濃 H2SO4 提供反應條件。4. 坂口反應

41、（精 aa的胍基）Arg 的胍基與次氯（溴）酸鈉及 萘酚在堿性條件下反應生成紅色產物，可用于鑒定含 Arg 的蛋白及測定 Arg 的含量。5. 酚試劑（堿性 CuSO4 及磷鎢酸鉬酸）反應酚基（Tyr）可還原磷鉬酸及磷鎢酸為蘭色的鉬藍與鎢藍。6. 與水合茚三酮反應生成藍紫色物質（似 aa）7. 黃色反應： Phe、Tyr 的苯環與硝酸生成黃色的硝基苯化合物。8. 與醋酸鉛反應生成黑色的硫化鉛沉淀（ Cys 與胱 aa 含量）9. 與考馬斯亮藍顯色（ 595nm吸收峰）。G-250 R-250第五節 蛋白質的分類分簡單與結合蛋白（按組分類）簡單蛋白：水解只產生 aa() 按溶解度可分為 7 類：

42、第15 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學清 Pr、球 Pr、谷 Pr、醇溶 Pr、組 Pr、精 Pr、硬 Pr。清 Pr：溶于水和稀鹽溶液 , 在飽和硫酸銨溶液中沉淀。球蛋白：不溶于水，只溶于稀鹽溶液，在半飽和的硫酸銨中沉淀，醇溶 Pr：不溶于水和稀鹽，可溶于稀酸、稀堿和 70-80%的乙醇。谷蛋白：不溶于水和稀鹽；可溶于稀酸、稀堿。精蛋白與組蛋白（堿性蛋白） ：溶于水和稀酸，為堿性蛋白。硬蛋白：在水、稀酸、稀堿與稀鹽溶液中不溶。主要存在于毛、發、角、爪、骨等組織中。結合蛋白： = 簡單 Pr + 非蛋白質組分（輔基） ，分為：1. 核蛋白 = Pr + 核酸：核糖體、染色質 2. 糖蛋

43、白 = Pr + 糖（共價鍵相連）糖的半縮醛羥基與 Pr 中的 Ser、Thr等的羥基以糖苷鍵相連 (O 連接) 或由糖的半縮醛羥基和 Asn 的酰氨基以 N 連接（脫水）。3. 脂蛋白：蛋白與脂類通過非共價鍵相連。其蛋白部分稱載脂蛋白，主要存在于膜上及動物血漿中，使脂類能溶于水中運輸。血漿脂蛋白：按密度分為，乳糜微粒、極低密度脂蛋白、 低密度脂蛋白和高密度脂蛋白 4 類（CM、VLDL、LDL、HDL），其蛋白質含量依次增加，而脂類 ( 包括固醇) 含量依次減少。4. 色（素）蛋白：其非蛋白輔基為色素如：血紅蛋白 = 珠蛋白 + 血紅素（原卟啉 + 二價鐵），H2O2E、細胞色素 C均由蛋白

44、質和鐵卟啉組成。 鐵卟啉CH由四個這樣的吡咯環和亞甲基連接成環狀N的原卟啉.5. 磷蛋白 = 蛋白質 + 磷酸（與 Ser、Thr 的羥基形成磷脂）。如：乳汁中的酪蛋白含有許多 Ser 磷酸殘基( 可結合大量鈣 ) 。有人提出按蛋白質的功能進行分類分為：酶（催化） 、激素蛋白（調節）、運輸蛋白（轉運）、運動、防御蛋白（抗體）、受體、毒蛋白、膜蛋白。非活性蛋白： 絲心 Pr、膠原 Pr、彈性 Pr、角 Pr。第16 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學第二章 核酸第一節 核酸的概念與重要性核酸：細胞核內含磷的酸性物質 DNA ：核、葉綠體、線粒體。RNA ：C 質中。細菌轉化實驗（ Avery

45、 艾弗里）,證明 DNA 是重要的遺傳物質 （從有毒肺炎雙球菌菌株提取的 DNA 能使無毒的同類菌株轉化成有毒菌株） ，為多核苷酸的高分子化合物。DNA ：作為遺傳物質，主要存在于細胞核中；真核細胞細胞器 DNA 只占 DNA總量的 5%。RNA ：少數病毒的遺傳物質。主要作用是轉錄 DNA 的遺傳信息，并指導蛋白質的生物合成，現發現有的有酶樣作用。 主要存在于細胞質內， 核內 RNA 只占 RNA總量的 10%。小 RNA 的作用（RNA 剪切）是近年來的研究熱點。第二節 核酸的組成成分水解：核酸 核苷酸 核苷 + Pi堿基 + 戊糖（ 嘌呤、嘧啶） （核糖、脫氧核糖 ）核糖與苔黑酚反應成綠

46、色，脫氧核糖與二苯胺反應成藍色一、核糖與脫氧核糖（分類依據） ：D 型。CH2OH HOH 2C CH2OHO OH O OOCH 3 D型核糖 D2脫氧核糖 D2O甲基核糖（RNA 中）二、嘌呤(嘧啶并咪唑 )堿與嘧啶堿：DNA 和 RNA 各含四種堿基，嘌呤同。A. G NH 2 O1N NHNNC 不足的鍵用 H 飽和 NH2N N N NO O IHNN H3CN N次黃嘌呤 1甲基次黃嘌呤 NNHHN NOXOHHN NNNONHN NHOHN黃嘌呤（酮、烯醇式）第17 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學OHNHN尿酸 含氧的堿基有酮式與稀醇式兩種互變異構體，酮式為主OONNHH

47、 NH 2O N3N HNN1ONHO NH嘧啶 尿嘧啶 胞嘧啶 O OHO H CH3 H NHN HN HHONONHO NH H HT U U 的烯醇式+嘧啶為堿性，六元雜環 N 原子的孤對電子不參與 P共軛，所以可與 H結 +合而顯堿性，咪唑環為酸性，其 N 的未共用電子對參與了環的共軛，結合 H能 +解離出來。顯負電荷，故嘌呤堿可結合 Ag+等。力減弱其氫可以 H三、核苷：核糖或脫氧核糖與堿基（脫水）形成的糖苷，叫核苷。核苷中的糖苷鍵通常是由核糖的半縮醛羥基與嘌呤堿的第 9 位 N 原子或嘧啶堿 、2、3 , 的第一位 N 形成糖苷鍵， 假尿苷：C 1C5，戊糖 C 原子標號為 1堿

48、基環中的原子標號為 1、2、3 ,ONH 2N NHNNHOH 2CNOOHOH 2CONA U( 假尿苷 /假尿嘧啶核苷 )第18 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學四、核苷酸：核苷中的核糖 OH 與 Pi 形成的 Pi 酯，核苷酸（也叫 P核苷）可分別形成 / / /2 、3、5核苷酸/ / /脫氧核苷酸只有 3和 5核苷酸，5的居多。如 AMP、GMP、dAMP、dGMP 等。無特殊指明均指 5/核苷酸。/ / /水解 DNA 或 RNA 得 5或3 核苷酸或脫氧核苷酸，核苷酸通常指 5核苷酸，pA：/腺苷酸， Cp：3胞苷酸，若為 2/需標明：Gp2 5在生物體內很少。+AMP +

49、 Pi ADP + Pi ATP 是RNA 合成的原料 寫出結構式！dATP、dGTP、dCTP、dTTP（脫氧胸苷酸）是 DNA 合成的直接原料。 UTP 參與糖合成； GTP 參與蛋白質的合成。 CTP 參與磷脂合成。 ATP：能量+（尼克酰胺腺嘌呤二 代謝。AMP：作為輔酶 FAD(黃素腺嘌呤二核苷酸 )、NAD+核苷酸）、NADP（尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸） 的結構組分。調節代謝：cAMP、cGMP、ppGpp（5二磷酸 32P鳥苷）、pppGpp、pppApp、pppAppp(休眠 與逆境)、A5pppp5A(與細胞的生長速度正相關 )。五、核苷酸的連接方式 DNA 和RNA 中3

50、5P 二酯鍵，核苷酸的戊糖和 P 構成核酸大分子的主鏈，堿基構成側鏈， P 基呈酸性，在生理 pH 下帶負電，嘌呤和嘧啶具有疏水性（DNA 形成雙鏈時堿基埋在里邊） 。每一鏈有 3末端和一 5末端（長鏈狀）- O5O=POCH2 GO-O3G1C AOH-OOH3P P P OH55O=POCH2 CO-O3pGpCpA OHOHOOHpG-C-A pGCA5O=POCH2O-O3AOH OHP：磷酸基團。簡寫式： pApCpGp GpU（ 表示核酸酶的酶切位點） 。p 可略 簡化式的讀寫： 左5 右 3(中間以 3，5磷酸二酯鍵連接， 如果不是應注明)。也是合成的方向！第三節 DNA 的結構

51、一、 一級結構： DNA 分子中四種脫氧核苷酸的排列順序。第19 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學生物大分子，分子一般在 5000b以上。二、 二級結構：雙螺旋結構 Watson Crick 1953提出。拉直后：5 3A C G T G C A T C T TT G C A C G T A G A A3 51. 內容如下：1）. DNA 分子是由兩條多脫氧核苷酸鏈組成的，方向相反 53，35以它們的糖 磷酸為主鏈，以共同的中軸，繞成右手螺旋，表面有大溝（兩圈間）和小溝（兩鏈間） 。2）兩條鏈上的堿基均在主鏈內側（相對的兩鏈中間） 。且以氫鍵相連，形成堿基對 AT、GC，其長度為雙螺旋的

52、 直徑 2nm，AT間兩個 H鍵，GC間三個 H鍵。互補配對原則。A的 1 位N 與T 的 3 位NH；A的 6 位氨基氫與 T 的 4 位氧形成氫鍵G的 1 位 NH與 C的 3 位 N；G的 6 位氧與 C的 4 位氨基氫， G的 2 位氨基氫與 C的 2 位氧分別形成氫鍵！第20 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學3）參數：堿基對平面垂直螺旋軸，糖環平面平行于螺旋軸，每個螺旋圈有 10個堿基對 ，每圈的 高度 3.4nm，相鄰堿基對之間的距離為 0.34nm，堿基堆積力 ( 疏水力) 和 H 鍵使雙螺旋穩定， 2 堿基對間旋轉的角度為 36 （后來的測定證明每個螺旋含 10.5 個堿

53、基對，高 3.6nm）。單鏈 DNA（ssDNA）以堿基數表示其大小 (b,nt) ，如病毒 x174，M13。2. 雙螺旋結構的依據1）X射線衍射圖譜：不同來源的 DNA圖譜相似，呈兩條具有螺旋結構的鏈，且有 0.34nm和 3.4nm兩種周期性變化（堿基對與螺旋圈） Wilkins Franklin2）層析法分析 DNA的堿基組成 A=T，GC（mol 比）。查蓋夫3）P基可用電位滴定，嘌呤和嘧啶不能滴定，說明埋在分子內形成了氫鍵。DNA雙螺旋的類型：類型 旋轉方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每圈的堿基對數目堿基對間垂直距離nm堿基對與水平面傾角A-DNA 75Na 2.3 2.8 11

54、0.255 20右B-DNA 92Na 2.0 3.4 10 0.34 0右Z-DNA CG 1.8 4.5 12 0.37 7左C-DNA 45Li 3.09 9.33 0.33 6右D-DNA AT 2.43 8 0.304 16右Watson.crick 模型 92%相對濕度的 DNA鈉鹽稱 BDNA。75%相對濕度的 DNA鈉鹽，為 ADNA結構隨條件而變化A-DNA與DNA-RNA雜交分子的構象及 RNA雙螺旋部分的構象同、短、粗。Rich 的ZDNA為人工合成的 d（CpGpCpGpC）p結G 晶，雙鏈繞成左手螺旋 DNA，P基在多核苷酸主鏈上的分布呈 “Z”字形， 所以叫 ZDN

55、A。表面只有一個溝 （另第21 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學一溝很狹），d(AC)n 也是- 左手螺旋，用 ZDNA制得的抗體可與動植物細胞核中的 DNA結合，說明天然 DNA也有左旋 DNA。改變相對濕度其螺距、每圈螺旋的堿基數、 螺旋直徑， 堿基對平面的傾斜角等都發生改變， 45%時稱 CDNA（鋰鹽）。AT交替的序列：每圈 8bp，螺距為 2.43nm，堿基平面傾角 16 ，稱 DDNA。T2 噬菌體的 DNA在相對濕度 95%時呈 B型，60%時呈 D型（類似），說明 DNA在體內是變化的。組成結構不同的部分螺旋結構也會有所不同。二 核酸的結構：雙螺旋 單鏈 三鏈(C-G-C

56、 或T-A-T) 使 DNA的 AT GC不等。三鏈結構 TTAGCAC CACGATT 四鏈結構： GGGGGGAATCGTG GTGCTAA GGGGGGTTAGCAC CACGATT GGGGGGGGGGGG三、DNA的三級結構DNA雙螺旋進一步盤繞扭曲即成三級結構。雙鏈 DNA的形式：線形、環狀（ dcDNA） 超螺旋 右手 負超螺旋左手 正超螺旋環狀 超螺旋（三級）在凝膠電泳中移動速度由快到慢的次序為：超螺旋 - 線形- 松弛或開鏈環形 ( 最慢 ) 。環形 DNA 的不同構象第22 頁 共 132 頁L:連環數 (二單鏈間纏繞數 )；T:扭轉數 (總纏繞數 )；W: 超螺旋數生命科

57、學學院生物化學松弛環形 DNA（不解鏈，不形成超螺旋）生物體無解鏈環形：復制、轉錄時的狀態負超螺旋：自然狀態；復制轉錄時可形成正超螺旋真核生物線形 DNA：繞組蛋白形成核小體（也是一種超螺旋）組蛋白：H1 H 2A H 2B H 3 H 4核小體（粒）的核心各 2 分子念珠狀結構進一步折疊、盤繞形成螺線管、突環、微帶及染色體，共壓縮8000-10000 倍。超螺旋的形成有利于 DNA的儲存，解開有利于其復制與轉錄。第四節 DNA 與基因組一、DNA與基因復制、轉錄、翻譯， DNA RNA Pr基因：DNA分子中最小的功能單位。分為 結構基因：編碼 RNA或 Pr調節基因：不轉錄成 RNA，只起

58、調節作用。某生物體所含的全部基因稱為該生物體的基因組。人體基因組共 2.5-3.5 萬個基因（也有報道 35 萬）。人類的 DNA共有約 30（29-32）億個堿基對（單倍體） 。在所有 DNA中，只有 1-1.5 的 DNA能編碼蛋白，人類基因組（包括非基因序列）中 98以上的序列都是所謂的“無用 DNA”，基因的平均大小為 27kb. 現已克隆出多個疾病基因和功能基因。二、原核生物基因組的特點（ DNA利用充分冗余少），如，大腸桿菌基因組已搞清1. 基因組小，只一個 DNA分子，大部分為結構基因（編碼蛋白） ，且為單拷貝。2. 功能相關的基因連在一起，同時轉錄在一個 mRNA分子中。如乳糖

59、操縱子：第23 頁 共 132 頁生命科學學院生物化學i p mRNA-半乳 - 半乳糖 - 半乳糖苷乳糖 糖苷酶 苷透過酶 轉乙酰基酶 (乙酰轉移酶 )3. 不同基因有重疊（甚至完全包含） ，讀碼框不同，利用充分。A B D E 如， X1744. 細菌中含許多被稱為質粒的小環形 DNA，可在細菌間轉移，可做基因載體。三、真核生物基因組的特點：基因組大，多個染色體，多個 DNA分子。容量大 其 DNA序列有如下特點：1. 有重復序列，如， GCATGCATGGCA,TG可以在不同染色體，或同一染色體的不同部位，由重復的多少可分為：1）. 單拷貝序列：只出現一次或少數幾次。主要是結構基因，人類

60、占總 DNA的 50%2）. 中度重復序列：可重復幾十次到幾千次。 tRNA、rRNA及某些 Pr 基因在人類細胞中占總 DNA的 30-40% 分為：散布重復序列和串聯重復序列。3）. 高度重復序列：重復萬次以上至幾百萬次，多為小于 10bp 的短序列，不編碼 RNA或 Pr，可能調控基因表達，富含 A-T 或 G-C對，離心時在非重復序列旁形成單獨帶，所以稱為衛星 DNA。（簡單重復序列 SSR：可作為標記研究） ，位于基因之間的特定區域（異染色質區） 。2. 有斷裂基因 內含子（intron ）：基因中不編碼的序列、外顯子（ exon）：基因中編碼的序列。一個基因可含有多個內含子， 使基