1、定量PCR實(shí)驗(yàn)要素及數(shù)據(jù)處理王爭強(qiáng)Hotline: 400 620 9660cnmcbsupport實(shí)驗(yàn)要素 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.實(shí)驗(yàn)要素zzzz目標(biāo)基因樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品陽性對照陰性對照監(jiān)控系統(tǒng)故障監(jiān)控污染zzz校準(zhǔn)生物學(xué)誤差校準(zhǔn)物理誤差降低隨機(jī)誤差內(nèi)參(管家基因)參比熒光重復(fù)實(shí)驗(yàn) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.模板質(zhì)量及濃度z DNA純度：OD /OD =1.8，1.6-2.0之間260280z DNA用量：0.1ng-100ngz RNA純度：OD /OD =

2、2.0260280z cDNA用量：10-100ng 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.標(biāo)準(zhǔn)品z 目的：生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立Ct值與濃度之間的線性關(guān)系z 要求： 濃度已知 5個(gè)及5個(gè)以上標(biāo)準(zhǔn)品 標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品的PCR效率一致，且接近100% 儀器質(zhì)量一致 試劑質(zhì)量一致：模板純度、引物和探針的Tm值、酶活性、緩沖液成分 反應(yīng)條件一致：循環(huán)參數(shù)相同、同一次實(shí)驗(yàn) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法z 選擇目標(biāo)提取/PCR 純化測定濃度調(diào)整濃度梯度稀釋z Ct值在18-30

3、之間，覆蓋全部樣品濃度區(qū)間z 10倍連續(xù)梯度稀釋方法：1v原液(標(biāo)準(zhǔn)品i) +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v 標(biāo)準(zhǔn)品iv +9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v不可由標(biāo)準(zhǔn)品i分別加不同體積的稀釋緩沖液直接得到標(biāo)準(zhǔn)品ii、iii、iv、v 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.標(biāo)準(zhǔn)品單位z 標(biāo)準(zhǔn)品的單位決定定量結(jié)果的單位z 根據(jù)最終目的選擇標(biāo)準(zhǔn)品單位 如果要求測定樣品的基因拷貝數(shù)，則梯度稀釋已知摩爾濃度的DNA片段 如果要求測定樣品的重量百分比%(w/w)，如

4、轉(zhuǎn)基因，標(biāo)準(zhǔn)品是將轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好轉(zhuǎn)基因DNA，再梯度稀釋，也不可分別抽提轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因DNA，再按重量比例混合（這樣得出的是基因重量百分比，而不是樣品重量百分比） 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR效率的測定K=-1/log(1+E) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.PCR效率對定量結(jié)果的影響n = 301+E = 1.95Y = X 1.9530 = X x 5.0 x 108相差2.2倍n = 301+E = 1.

5、90Y = X 1.9030 = X x 2.3 x 108Y=擴(kuò)增產(chǎn)物，X=起始濃度，E=擴(kuò)增效率，n=循環(huán)數(shù) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Question？ 標(biāo)準(zhǔn)品DNA與目標(biāo)DNA必須是一樣的嗎？ 當(dāng)檢測多個(gè)基因時(shí)，需要分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.陽性對照z 內(nèi)參(管家基因)z 標(biāo)準(zhǔn)品 線性范圍 靈敏度 擴(kuò)增效率z 外源陽性內(nèi)對照z 來源 PCR產(chǎn)物 質(zhì)粒 陽性樣本 2009 Applied Biosystems. All Rights Rese

6、rved.陰性對照z 實(shí)驗(yàn)效果驗(yàn)證z 種類 No Template Control No RT Control No Probe Controlz 如何分析 電泳 融解曲線 測序 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.內(nèi)參(管家基因,Endogenous Control)為什么需要陽性內(nèi)對照(IPC)?z 內(nèi)參用于校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)過程對定量結(jié)果的影響 核酸提取時(shí)通常以重量或體積為單位取樣，再加上提取效率和操作誤差，造成等量提取物不一定來源于等量細(xì)胞（或基因組） 將定量結(jié)果校正為以細(xì)胞（或基因組）為單位，不同樣品之間才具有可比性 校準(zhǔn)方法：目的基因/內(nèi)

7、參=均一化的目的基因表達(dá)量z 內(nèi)參可以起到陽性對照的作用，以監(jiān)控反應(yīng)系統(tǒng)是否正常試劑、PCR程序、熒光采集、是否存在抑制物 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.內(nèi)參的選擇z 在所有待測樣品中，內(nèi)對照的表達(dá)量都應(yīng)當(dāng)恒定不變z 內(nèi)參常選用管家基因，如18S rRNA、-actin、GAPDH等z 使用Human Endogenous Control Plate (PN：4309920)測試，從中選擇合適的管家基因 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Question？在使用TaqMan MG

8、B探針的情況下，你認(rèn)為管家基因與目標(biāo)基因是在同一管內(nèi)做多重定量好，還是分成兩管分別定量好？哪一種檢測的數(shù)據(jù)更精確？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.參比熒光z Master Mix中Rox濃度固定z ROX不參與PCR擴(kuò)增，信號(hào)強(qiáng)度只與Master Mix用量有關(guān)z ROX的功能：耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能）、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間波動(dòng)）等的誤差，反應(yīng)體系監(jiān)控(蒸發(fā))ReporterR = R / RnFAMROXReporterReferenceRnRnReference 2009 Applied Biosystems. All

9、 Rights Reserved.ROX校準(zhǔn)增加數(shù)據(jù)精度 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.重復(fù)實(shí)驗(yàn)z 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)z 重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求z 小樣本統(tǒng)計(jì)n6 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.誤差的校正z 生物學(xué)方面的誤差：內(nèi)參校正細(xì)胞數(shù)量的差異、抽提效率、純化損失、反轉(zhuǎn)錄效率等z 物理方面的誤差：ROX校正耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動(dòng)）的誤差等，反應(yīng)體系監(jiān)控（蒸發(fā)）z 隨機(jī)誤差：統(tǒng)計(jì)校正重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值

10、2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.數(shù)據(jù)處理 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量與相對定量絕對定量相對定量600個(gè)拷貝相差10倍 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量與相對定量z 絕對定量Copy #10000900080007000 優(yōu)點(diǎn)：給出目標(biāo)基因的絕對數(shù)量，數(shù)據(jù)容易處理10000 缺點(diǎn)：必須有標(biāo)準(zhǔn)品，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，難以制備和質(zhì)控60005000400030002000100050000Sample 1Sampl

11、e 2z 相對定量Fold Chg2 優(yōu)點(diǎn)：可以不做標(biāo)準(zhǔn)品；相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法的標(biāo)準(zhǔn)品容易制備；使用廣泛21.751.5 缺點(diǎn)：數(shù)據(jù)理解困難1.25110.750.50.250Sample 1Sample 2 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量：絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線法1250 copies2500 copies5,000 copiesUnk1 Ct=24.810,000 copies20,000 copiesUnk1濃度=4000 拷貝 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量：數(shù)據(jù)處

12、理如果需要對不同樣本的絕對定量數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，則需內(nèi)參校準(zhǔn)IL-218S目標(biāo)基因管家基因如 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量：樣品設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品陽性內(nèi)對照陰性對照樣品 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相對定量z 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法z 比較Ct法（CT法） 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.絕對定量：數(shù)據(jù)處理z 管家基因校準(zhǔn)(Normalization Gene) 得出每個(gè)細(xì)胞中的目的基因 目標(biāo)基因 vs.管家基因目標(biāo)基因管家基

13、因IL-218S如z 對照樣品校準(zhǔn)(Calibrator Sample) 得出相對于某個(gè)樣品的基因表達(dá)量SampleCalibrator處理后處理前如 處理的 vs. 未處理的，6 hr vs.0 hr, 病理vs. 正常. 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相對定量：相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法1/16 a1/8 aUnk2 Ct=25.8 aUnk1 Ct=24.8 aaUnk1 濃度= 0.2 aUnk2 濃度= 0.1 a相差2倍標(biāo)準(zhǔn)品只知道稀釋倍數(shù) 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相對

14、定量：比較Ct法R2-Ct 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相對定量：比較Ct法IL-2 18S DCtDDCt 2-DDCtT=0 (calibrator)T=1hrT=6hr24 9 1524 10 1423 11 1228 10 180 1.0-1 2.0-3 8.03 0.1T=24hr1088.0t = 06t = 1 ht = 6 ht = 24 h42.00.1120 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.相對定量：比較Ct法 2009 Applied Biosystem

15、s. All Rights Reserved. CT法要求PCR效率一致且接近100%，標(biāo)準(zhǔn)曲線法沒有這樣的要求，對不對？ 相對定量要做管家基因嗎？ 相對定量要做重復(fù)實(shí)驗(yàn)嗎？ 加樣量不同，相對定量的結(jié)果會(huì)隨之改變嗎？ 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.Ct值與相對定量結(jié)果總RNA多總RNA少BABAthresholdthreshold10 1525 30CT=5CT=5循環(huán)次數(shù)只要PCR效率相同，CT 就保持恒定 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.結(jié)果評價(jià) 2009 Applied

16、Biosystems. All Rights Reserved.注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)室分區(qū)：樣品處理區(qū)、PCR反應(yīng)制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū) 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋最好使用獨(dú)立的一套移液器 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液中最好含有Carrier RNA 移液器使用帶濾芯的吸頭 先陰性對照樣，后加樣品，再加低濃度標(biāo)準(zhǔn)品，最后加陽性對照 PCR管上不可用記號(hào)筆標(biāo)記 PCR管使用平蓋或光膜，不要裸手觸摸光蓋或光膜表面 PCR管或8聯(lián)排管要對稱放置 反應(yīng)后的PCR管應(yīng)當(dāng)直接廢棄，切不可在實(shí)驗(yàn)區(qū)域內(nèi)開啟 采用UNG防污染系統(tǒng)，消除前次擴(kuò)增產(chǎn)物的污染影響 2009 Applied Biosystems. All Rights Reserved.分析流程查驗(yàn)擴(kuò)增曲線檢查/ 調(diào)整基線檢查/ 調(diào)整閾值檢查NTC檢查 陽性對照檢查 樣品數(shù)據(jù)分析特定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 2009 Applied Bi