1、伊/ k f研究生課程作業（綜述）41題目：纖維素酶的結構與功能食品學院食品工程專業學號學生諜程食品酶學 指導教師二0一三年十二月纖維素酶的結構與功能摘要：人類的生命活動離不開酶，生物體的一切新代活動都離不開酶，并且 工業酶產業正在迅速發展。本文簡單闡述了酶的結構與功能，重點以纖維素 酶為例子，闡述它的來源、結構、分類、催化機制以及在各行業的應用，并 對纖維素酶的發展前景作了一定展望。關鍵詞：纖維素酶 結構 家族 功能The structure and function of cellulaseAbstract:Humans life activities is dependent on th

2、e enzyme,and all the metabolic activity of organisms cannot leave the enzyme, and industrial enzyme industry is developing rapidly.This article simply expounds the structure and function of enzymes.The key to cellulose enzyme as an example,expounds its source,structure, classification,catalytic mech

3、anism and application in various industries,and lastly expect the development prospect of cellulase.Keywords: cellulase structure family function1前言酶是生物體組織或細胞具有特殊催化活性的蛋白質，亦稱生物催化劑。 根據蛋白質分子的組成和盤曲折疊方式，可以將酶分為一級結構和高級結構（二級結構和三級結構），與酶的催化功能密切相關，結構的改變會弓1起酶催 化作用的改變或喪失。1955年Sanger等報導了胰島素的氨基酸序列，人們開 始把視線注意在酶的結構上

4、。隨后1963年，核糖核酸酶的一級結構被測定， 之 后用 X-ray crystallography 測定了 ribonulease, lysozyme, chymotrypsin,trypsin, papain和carboxypeptidaseA的三級甚至四級結構。一級結構就是指蛋白質分子 中肽鏈的氨基酸殘基的排列順序，由于半胱氨酸側鏈的巰基經氧化后，能形 成一SS一鍵，因此在蛋白質分子的鏈成鏈間都有可能形成二硫鍵；二級結 構指蛋白質分子的肽鏈本身三維空間的規律性；三級結構就是蛋白質的二級 結構按照一定方式再盤曲折疊，并通過氫鍵和疏水鍵維系的結構。且酶蛋白 的一級結構是基礎，但必須有一定的空

5、間構型（一般指二級、三級結構）時 才呈現活性1。酶的基本組成單位是氨基酸，20種氨基酸按不同順序排列組合而成具有 一定空間結構的多肽鏈，各種氨基酸還具有不同的側鏈，各種側鏈又有不同 的化學反應性。它們的相互作用形成各種化學鍵，如離子鍵、氫鍵、疏水鍵 等。酶分子的特定化學結構反映了一定的催化功能。酶與那些化學催化劑相 比，有一些顯著的催化功能，比如高效催化能力，以及在溫和反應條件下的 高度選擇性。在有機合成領域，酶已經被作用催化劑選擇性的合成有機混合 物。所有的天然高分子聚合物生產都是通過酶的體催化得到的2。1961年國際酶學委員會（Enzyme mittee，0根據酶所催化的反應類型 和機理，

6、把酶分成6大類。加表1所示：表1的分類及其反應本質大類反應本質亞類亞一亞類氧化還原酶電子轉移供體中被氧化基團的性質受體的類型轉移酶基團轉移被轉移基團的性 質被轉移的基團的進一步描述水解酶水解被水解的鍵的類 型（酯鍵、肽鍵）底物的類型：糖苷、肽等裂合酶鍵裂開被裂開的鍵：C-S、C-N等被消去的基團異構酶異構化反應的類型底物的類別、反應 的類型和手性的 位置連接酶鍵形成被合成的鍵：C-C、底物S1、底物S2、C-O、C-N等 第三底物(共底物)幾乎是核苷酸自然界中，一切生命現象都與酶有關，生物體的新代過程都在酶的催化 作用下進行，并受酶的控制和調節。如果離開了酶，新代就不能進行，生命 也就停止。因

7、此，酶學的研究有著重大的理論和實踐意義。近年來，分子生 物學領域，在不斷涌現的新方法和新技術的推動下，使酶的結構與功能的關 系愈加清晰。本文以纖維素酶為具體例子，詳細介紹了纖維素的來源、結 構、催化機制、應用等容。2纖維素酶的概念自1906年從蝸牛消化道發現纖維素酶以來，陸續報道了細菌、放線菌、 絲狀真菌等許多微生物中纖維素酶的存在。1954年開始，美軍Natick實驗室 就已研究了軍用纖維素材料微生物降解的防護問題，后來發現纖維素經微生 物降解后，可產生經濟、豐富的生產原料，且有望解決自然界不斷產生的固 體廢物問題，于是纖維素酶得到了廣泛的關注。2.1纖維素酶的來源不同的微生物合成的纖維素酶

8、在組成上有顯著的差異，對纖維素的降解能力 也大不相同。自然界可以產生纖維素的微生物主要有細菌、放線菌、真菌 等。由于放線菌的纖維素酶產量極低，研究很少；細菌的產量也不高，且主 要是切葡聚糖酶，大多數菌所產纖維素酶對結晶纖維素沒有活性，另外，所 產生的酶是胞酶或吸附于細胞壁上，很少能分泌到細胞外，增加提取純化難 度，在工業上很少應用。目前，用于生產纖維素的微生物菌種大多都是絲 狀真菌,其中產酶活力較強的菌種為木霉屬(Trichoder-ma)、曲霉屬(Aspergillus) 和青霉屬(PenicHlium),特別是里氏木霉(Trichoderma reesei)及其近緣菌株較為 典型。絲狀真菌

9、具有產酶的諸多優點：產生的纖維素酶為胞外酶，便于酶的 分離和提??；產酶效率高，且產生纖維素酶的酶系結構較為合理；同時可產 生許多半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。同時，其生長環境粗放、酶易提取， 且菌株安全無毒，因而里氏木霉被公認為是最具有工業應用價值的纖維素酶生 產菌。2.2纖維素酶的結構關于纖維素酶的結構，第一次報道是Pettersson和Bhikhabhai關于里氏木 霉的I型外切纖維素酶的氨基酸序列中，發現其與來自同物種的切葡聚糖酶相 關。絲狀真菌所產的典型游離纖維素酶分子具有多結構域的構架，包括碳水 化合物結合模塊(Cellulose-binding module，CBM)，其通過柔性的

10、連接肽(Linker) 連接至催化結構域(Catalyticdomain，CD)上，另外部分酶分子還含有其他結 構域。構成厭氧細菌纖維小體的纖維素酶分子一般由一個對接模塊(Dockerin) 通過連接肽與一個催化結構域(CD)連接，其中對接模塊可與支架蛋白 (Scaffoldin，又稱作腳手架蛋白)的粘連模塊(Cohesin)結合，而支架蛋白一般 還會存在一個CBM5oCBM在結合及降解天然纖維素的過程中具有重要作用； 而CD則主要是催化糖苷鍵的斷裂。纖維素酶包括三個酶活性：切葡聚糖酶 (Endoglucanase，EG； EC 3.2.1.4)，可以切斷纖維素鏈的阡1,4鍵；外切葡聚 糖KC

11、ellobiohydrolase， CBH ； EC 3.2.1.91，EC3.2.1.176)又稱纖維二糖水解 酶，可以移除自由鏈端的纖維二糖；阡葡萄糖苷i(B-glucosidase，BGL； EC 3.2.1.21)，可以水解纖維二糖成為葡萄糖單元回。不同來源、不同組分的纖維素酶分子量差別較大，如Geotrichum candidum 產生的一種切葡聚糖酶，其分子量為130000D，而斜臥青霉的EG的一個組分， 分子量僅24000D。纖維素酶分子的一級結構都具有類似的結構，即由球狀的 催化結構域、鏈結區和纖維素結合結構域（CBD ）三部分組成。從酶分子的高 級結構來說，不同來源的酶分子又

12、具有不同的高級結構。如 Clostridium cellulovorans 包括兩個多纖維素酶體，每個小體又都包含9個相同組分的亞單 位，而其中一個小體的酶活性是另一個小體活性的4倍，足以說明纖維素酶 組成的復雜怕刀。2.3纖維素酶的家族根據蛋白質結構域中氨基酸序列的相似性，將不同物種來源的碳水化臺 物活性酶類（Carbohydrate-Active enZYmes，CAZy）分成不同的蛋白質家族，將蛋 白質氨基酸序列相似度高于30%的歸為同一GH家族。其中糖苷水解酶現已 有131個家族，纖維素酶類分布在至少17個GH家族中，是糖苷水解酶數 據庫中家族數目最多的一類水解酶類。不同家族的纖維素酶

13、具有不同的演化 歷史和進化起源，因此不同GH家族之間的親緣關系不同，有的親緣關系比較 近，如GH7家族只含有真菌的水解酶類，GH8家族只含有細菌產生的水解酶 類等；有的親緣關系較遠，如GH9家族的纖維素酶，產生該類酶的生物種類 廣泛，有細菌（包括好氧菌和厭氧菌）、真菌、植物與動物（原生動物與白蟻）， 另外GH5與GH12家族的成員也廣泛分布于古菌、細菌與真菌三類生物中。不同的微生物產生的纖維素酶屬于不同的類別，加隸屬于絲狀真菌的瑞 氏木霉TrichodermaReesei （紅褐肉座菌Hypocreajecorina 的無性型），其分泌 的纖維素酶主要分布于GH5, GH6, GH7, GH1

14、2, GH45與GH61家族；放線 菌中的褐色高溫單孢菌Thermobifidafusca主要有來自GH5, GH6, GH9與 GH48家族的相關纖維素酶基因；而好氧細菌中哈氏噬纖維菌 Cytophaga hutchinsonii主要產生GH5與GH9家族的相關纖維素酶叫厭氧細菌中的熱 纖梭菌 Clostridium thermocellum 主要產生 GH5, GH8, GH9 與 GH48 家族的 相關蛋白。同一家族具有相同的催化斷鍵機制，同一族系，甚至不同族系都 可能會具有相同的斷鍵機制9。表2列出了部分主要纖維素酶家族的蛋白結構 折疊類型、催化機制及其他主要信息。表2主要纖維素酶家族

15、的基因序列、拓撲結構、催化機制及其成員信息統計GH feinilyNumberFgeneNumber ofPDB1/ rtnidnires3D structure 枸usClanSCOF foldCatalytic iiLedianistnCatalytic proton donorCatalytic nudaaplule/ baseEdD42d/8（顯弟GH-MInvrrlingG1L1Aqj91448頊1。(afa)6a/a toroidInvertingA叩Glu4S10212/3O毗GH-MInvertingGlu639339/97-：sirandcrt 阪 barrelInverti

16、ngAnyA叩45215SMDoublets p-bandInvertingAspA棗7494745/9b-jellyGH-BRetainingGluGlurollConcaMvalm A-tike ID3引1，tiT nllyLectitis/gjucana sesRftaini 迎12rdLGH-CGinGin53401113/37（阿GH-ATIM 隕-bandR.?tanuQgGinG1L144RctaimnEGluGlu3纖維素酶的催化機制及應用3.1催化機制纖維素是地球上最豐富的生物資源，最初是在植物和海藻的細胞壁結構 中發現的，同時也可以從其他的途徑生產纖維素，比如細菌。纖維素是

17、由 伊1,4-糖苷鍵連接D-葡萄糖單元形成的一條線性高分子鏈，超過10000個葡 萄糖殘基。由于纖維素的結構非常緊密，很難通過一些化學方法將其徹底水 解，要利用纖維素生產綠色能源是一個難題。而纖維素酶卻能高效水解纖維 素酶。目前我們了解到，纖維素酶直接作用于纖維素，最開始的兩個酶行為是， 將其分解為纖維二糖和葡萄糖，這是在切纖維素酶和外切纖維素酶的協同作 用下實現的。這種纖維二糖隨后被纖維二糖酶水解成為葡萄糖。川葡聚糖酶 和外切葡聚糖酶可以分解水落性纖維糊精和非晶態纖維素，但是外切纖維素 酶是降解晶態纖維素的最佳酶皿。纖維素酶水解纖維素的催化機制如圖1所示 uh。它揭示了在降解完整纖維素體系過

18、程中觀察到，在經過大量水解后纖維 素分子結構幾乎沒有發生很大變化的原因，可以歸結于單個酶分子是對酶分子的不同部分進行修改。圖1 C.fimi酶降解纖維素的示意圖（其中，直線表示結晶纖維素，鋸齒線表示非結晶纖維素。由示意圖可以看 出，Cel6A是一種與非結晶纖維素具有高度親和力的非連續性切葡聚糖酶，同 時Cel5A是一種弓|起非結晶纖維素解聚的連續性切纖維素酶；Cel6B是一種進 攻纖維素非還原性末端的外切葡聚糖酶，同時Cel48A是一種分解纖維素還原 性末端的連續性外切葡聚糖酶）3.2應用纖維素酶廣泛應用于植物性農產品加工、飲料和調味品的釀造、紡織工 業、級回收、清潔劑酶、動物飼料添加劑等方面

19、。隨著石化能源的日益枯竭，生物資源由于其資源豐富、可再生性和不增 加溫室氣體排放等優點，正日益弓1起政府和社會的重視。采用纖維素酶將生 物質水解為糖，再發酵可產生物液體燃料（加生物乙醇、丁醇和碳氫化合物 等），為解決能源危機展現了新的曙光。若纖維素酶水解生物質產生的乙醇、 丁醇或其他糖發酵產品成為主要運輸燃料，那么纖維素酶將會成為世界第一 大工業。為降低成本，植物基因工程正致力于研究利用植物自身生產纖維素 酶來講解纖維素12J且蛋白質的多樣性，需有效地講解植物細胞壁，并且由于 真菌產酶的多樣性，建立一個與真菌產酶活性相當的植物產酶體系是相當困 難的。Saeid Karkehabadi等人13致

20、力于降低生物生產乙醇的成本做了研究，從 嗜熱菌中發現了一種61家族蛋白，它可以提高T.reesei粗纖維素酶預處理玉 米秸稈的活性，使酶成本降低了數倍。并且T.reesei菌中含有多種61家族基 因，并且61家族蛋白結構中不含油類似于纖維素結合位點的區域。具體來說，纖維素在食品行業，一方面主要進行橄欖油以及果蔬汁的榨 取，去除掉果蔬汁以及蔬菜汁的沉淀物，促進谷物水分吸收，去除豆子中的 豆衣，實現谷物蛋白以及淀粉的成功分離等；另一方面，纖維素可以用于提 取纖維寡糖等可落性糖，脫粒細胞壁，取出有用的蛋白等。在紡織行業中， 紡織行業纖維素酶的應用仍然屬于比較新興的應用，主要用于拋光以及打磨 兩個階段

21、，日常應用圍也比較廣，主要是能夠有效的取出衣物表面存在的碎 纖維，方便家庭日常的洗滌工作，通過拋光以及打磨兩個階段，提高衣物光 澤。在制酒工業中，纖維素酶主要有力于葡萄酒以及啤酒的制造，利用纖維 素酶，能夠促進水解制酒過程中葡萄汁以及大麥汁，有效的分解沉淀物，提 高過濾的效率，增加酒香，提高釀酒的效率，促進釀酒業的發展。飼料行業 我我國農業的基礎，是保證滿足十幾億人口大國溫飽的關鍵環節，而纖維素 酶又是其中的重點問題，纖維素酶加入到飼料當中，能夠起到很好的補充作 用，增強動物體能，防止動物反芻事件發生。除此以外，還能通過應用在纖 維素物質加去掉谷物殼等中，有效提高動物消化的效率，并且分泌相應的

22、物 質，促進動物體的粗糙糧食得到消化以及吸收。4總結與展望纖維素酶作為一種生物工程主要建設工業酶，其成功的提取以及應用， 對于保證我國解決能源以及食品問題，促進我國農業發展有著空前意義，纖 維素酶憑借其價格以及成本低廉、應用廣泛、使用方便等特點，已經成為人 們關注的熱點話題之一。而天然的來自真菌的纖維素酶大多為酸性酶，在堿 性條件下不能有效地發揮作用，而且纖維素酶的活性和熱穩定性有限，不能 滿足使用的需要。蛋白質工程技術和酶的體外定向進化技術為天然纖維素酶 分子的改造提供了有效的途徑?？梢栽诨蛩缴?，通過定點突變、易錯PCR、 DNA改組(DNAShuffling)、克隆等手段產生各種各樣的

23、突變體，再從中篩選出 符合人們需要的性質改善的突變酶，如耐堿性酶、比活力提高的酶、熱穩定 性提高的酶等，最后，將該突變酶的基因高效表達，或者弓1回原宿主同源置 換野生型基因，即獲得了經分子改性的高效纖維素酶產生菌。隨著基因組學、蛋白質組學、結構組學等技術的迅速發展，以蛋白家族的序 列比對與結構模建為基礎，通過分析纖維素酶序列、結構與功能的進化關系, 研究酶分子的活性架構及其持續性催化的分子動態過程，有助于闡明其催化 機制，從而奠定理性設計的理論基礎。可以預見的是，隨著越來越多新的基 因被克隆出來和新的分子設計理念的出現，微生物酶的應用前景會越來越好。 因此，人們還必須不斷的改進現有的纖維素酶分

24、子改造技術，探索發明新的 更高效的文庫構建和篩選方法，以期為纖維素酶改造成為更加穩定，更加適 應外界環境條件創造更加誘人的前景。編.參考文獻袁靜明.酶的結構與功能J.生物化學與生物物理進展,1975,01:47-55.Hiroshi Uyama,Shiro Kobayashi.Enzyme-catalyzed polymerization to functional polymersJ.Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2002,19: 117-127.紅歌,東升，亮偉.纖維素酶菌種選育研究進展J.農業科學,2008, 08:5-7.Macromo16cules V6g6tales.Cellulases and their interaction with cellulose*J.CELLULOSE,1994,1:169-196.王金蘭，王祿山,巍峰，等.降解纖維素的超分子機器研究進展.生物化學與 生物物理進展J,2011,38(1):28