1、細胞的凍存細胞深低溫保存的基本原理是：在一70C以下時，細胞內的酶活性均己停止，即代謝處于 完全停止狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過）20C階段的處理過程。在 此溫度范圍內，水品呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。總的原則是緩慢凍存！ ！ 一材料：生長良好之培養細胞，新鮮培養基，DMSO,無菌塑料冷凍保存管，血球計數盤與蓋玻片。二步驟：2.1冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形，最好細胞應該處于對數生長期。配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMS0加入新鮮培養基中，最后濃度為5-10%，混合 均勻，置于室溫下待用。避免因臨時配制產熱而傷害細胞依細胞繼代培養之操作，收

2、集培養之細胞與凍存管內，取少量細胞懸浮液（約0.1 mL）計數 細胞濃度。先將凍存管放入4二冰箱，約40min。2.5接著置于-20C冰箱，約30-60min。20 C不可超過1小時，以防止冰品過大，造成細胞 大量死亡，亦可跳過此步驟直接放A-80C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。置于-80超低溫冰箱中放置過夜。置于液氮罐中長期保存。2.8同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。三注意事項：使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的 分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時最好戴上手 套操作?；旌螪MSO要快

3、，因為DMSO對細胞有毒性，混合之后應盡快凍存，提醒各位注意的 是加入凍存液后一定要混勻，防止DMSO沉淀。凍存液比例：培養基7：血清2： DMSO1，也 有將血清比例加大的做法，有的甚至將血清提高到90%，具體濃度視經驗而定，但是好多人認 為小牛血清含量越高越好！不宜將凍存細胞放置在0C-60C這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區 內，是“危險溫區”?？梢韵仍谂菽洗蚩?，把凍存管塞進去。這樣降溫可以慢一點，當然包上 棉花也是不錯的主意。注意定期檢查液氮罐內液氮量，及時添加。3.4 -20 C不可超遏1小畤，以防止冰品遏大而造成名田胞大量死亡，亦可跳遏此步驟，冷7柬管 置於厚保履育

4、盲內，直接放A-80C冰箱中，但存活率畬降低一些。但是大多數人：4度半小時， 一20度半小時，一80度過夜，液氮保存。3.5冷7柬管內名田胞敷目一般至少舄10*6-7/mL以上，凍存細胞健康程度一般要求活細胞在95% 以上，細胞活力差的在凍存后的成活機率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。3.6細胞凍存管一般有1.5-2mL左右體積，原則上可以存放1.5mL充滿均勻懸浮細胞的凍存液， 一些人喜歡灌注1-1.5mL凍存液凍存，這實際上并不好。原因如下：凍存液凍存需要一段時間， 如果這段時間凍存管傾斜，液體容易流到管口，很容易在后續的操作中造成污染。建議0.5-1mL 之間即可。但是還是用1

5、.5mL的話，具體操作時，凍存管直立起來放在-20的冰箱里，這樣不 容易造成污染。同時凍存細胞的時候，一定加上封口膜，這樣可以避免復蘇的時候，水浴箱里的水進入蓋 子的縫隙中！凍存管外面用封口膜封上后，最好再用白膠布再封一下。這樣可以防止細胞復蘇 時，封口膜崩裂，水浴箱中的水進入凍存管。3.7提醒：細胞凍存在-4度，或一20時就忘了，我干過好幾次這樣的事（這幾次細胞種很好， 很心疼），其實可以將凍存細胞時用厚厚的棉花把凍存管包起來，直接放進一70度冰箱，復蘇 效果也不錯。3.8注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22 micronFGLP Telflon 過濾或是直接

6、購買無菌產品，如Sigma D-2650），以510 ml小體積分裝，4C避光保存，勿作 多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用， 因長期儲存后對細胞會有毒性。細胞凍存和復蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經 費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。凍存和復蘇的原則：慢凍快融當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并 在細胞內形成冰品。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰品；相反.結品就大，大結品 會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的

7、是防止小冰品形成大冰品，即冰 品的重結品。慢凍程序標準程序：當溫度在-25 C以上時，12 0min當溫度達-25 0以下時，510 C/min當溫度達-100C時，可迅速放入液氮中簡易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定 于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 C的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直 接投人液氮中。更簡單的：也可以在凍存細胞時用厚厚的棉花把凍存管包起來，直接放進一70度冰箱，復蘇效 果也不錯。在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一 種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性

8、，降低冰點，延緩凍結過程，能使 細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰品，減少胞內冰品，從而減少冰品對細胞的損 傷。細胞凍存步驟1、 預先配制凍存液：含20%血清培養基、10% DMSO；冷凍保護劑濃度為5或10% DMSO， 若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失 敗。2、取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（1x1065 x106 細胞 /mL）；3、加入1mL細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。為了保證培養細胞系的 完整性，必須進行詳細的實驗記錄，應包括以下內容：細胞系的種類及

9、來源、有無污染（如細 菌，病毒，支原體）、細胞代數和倍增時間、以及選擇性突變4年后，存活率可達80%90%。DMSO液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細 胞。細胞復蘇方法1操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。2自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。 凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。冷凍管于放入和取出液氮桶 時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。3將新鮮培養基置于37C水槽中回溫，回溫后噴以70 %酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。 4取出冷凍管，立即放入37C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，

10、以70 % ethanol擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。注意水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染5用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒 的離心管、吸管、培養瓶等等。取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。取出0.9 mL解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內（稀釋比例1:101:15），混合均勻，放 入。02培養箱培養。另取0.1 mL解凍細胞懸浮液作存活測試。6解凍后是否立即去除冷凍保護劑（例如DMSO或glycerol），依細胞種類而異，一般而言，大 都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之

11、細胞懸浮液加入含有5-10 mL培 養基之離心管內，離心1,000 rpm, 5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2 培養箱培養。（一定要用這么多培養基清洗么，其他緩沖溶液是否可以呢？）細胞計數：細胞濃度以5X105/mL為宜。將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內 繼續培養。7若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。8細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常（例如產生 單株抗體或是其它蛋白質）。細胞欲冷凍保存時，細胞濃度應該多少？normal human fibroblast: 13 x106 cells/mLhybrido

12、ma: 13 x 106 cells/ mL，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在 解凍24小時后死去。adherent tumor lines: 57 x 106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而 HeLa 只需 1-3 x 106 cells/mL。other suspensions: 510 x 106 cells/mL, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/mL。冷凍管內細胞數目一般為510 x106 cells/mL，融合瘤細胞則以5x106 cells/mL為宜。Thawing of Cell

13、s / Initiation of Culture ProcessThe recommended seeding density for HMVEC-D, HMVEC-dLy, HMVEC-dBl, HMVEC-L, HMVEC-LLy, HMVEC-LBl, HMVEC-Bd, HMVEC-C and UtMVEC-Myo is 5,000 cells/cm2 and the recommended seeding density for HUVEC, HCAEC, HPAEC, HAEC, HIAEC, HUAEC, bAEC, bCAEC, and bPAEC is 2,500 to 5

14、,000 cells/cm2.To set up cultures calculate the number of vessels needed based on the recommended seeding density and the surface area of the vessels being used. Add the appropriate amount of medium to the vessels (1 ml/5 cm2 ) and allow the vessels to equilibrate in a 37 C, 5% CO2, humidified incub

15、ator for at least 30 minutes. Do not seed cells into a well plate directly out of cryopreservation.Wipe cryovial with ethanol or isopropanol before opening. In a sterile field, briefly twist the cap a quarter turn to relieve pressure, then retighten. Quickly thaw the cryovial in a 37 C water bath be

16、ing careful not to submerge the entire vial. Watch your cryovial closely; when the last sliver of ice melts remove it. Do not submerge it completely. Thawing the cells for longer than 2 minutes results in less than optimal results.Resuspend the cells in the cryovial and using a micropipette, dispense cells into the culture vessels set up earlier. Gently rock the culture vessel to evenly distribute