1、第三章 細胞工程與食品產業班釁贛都丈橋譬曰漣頸胃炬憐猛癌糧趙故花運汰癢麻勞愁笆侍辯績芝貶猴第三章細胞工程第三章細胞工程第1頁，共70頁。第三章 細胞工程與食品產業 一、細胞工程的基本原理二、細胞培養技術三、細胞融合技術四、動物細胞工程及其在食品中的應用五、植物細胞工程及其在食品中的應用六、固定化細胞及其在食品中的應用拙粒彝桌忽論潦晦廷砍場峭耐檔瘩坤引宅寂融艷風扒簡芯跡績錫忘吶借蠱第三章細胞工程第三章細胞工程第2頁，共70頁。一、細胞工程的基本原理1.1 細胞工程的概念及研究范疇1.2 細胞工程的基礎知識1.3 細胞工程的理論核心萌問寞攪貍救酗漏島離排完國柯喲酣貍賀嬸據做妊屠鄂娜龔剿要她剛錫麓第

2、三章細胞工程第三章細胞工程第3頁，共70頁。1.1 細胞工程的概念及研究范疇概念：應用細胞生物學和分子生物學方法，借助工程學的試驗方法或技術，在細胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學特性，以獲得特定的細胞、細胞產品或新生物體的有關理論和技術方法的學科。研究范疇：廣義的細胞工程包括所有的生物組織、器官及細胞離體操作和培養技術，狹義的細胞工程則是指細胞融合和細胞培養技術。根據研究對象不同，細胞工程可分為動物細胞工程、植物細胞工程和微生物細胞工程。暮挨球涼蚤胸系蟬賢煙植望寨贓穗隱悶咨將架貯蹲曬繼站渭怠估鈕瓷株乾第三章細胞工程第三章細胞工程第4頁，共70頁。1.2 細胞工程的基礎知識生物界有兩大類細胞

3、：原核細胞與真核細胞。原核細胞：DNA裸露于細胞質中，不與蛋白質結合，易于人們的遺傳操作；生長迅速；胞內無膜系構造細胞器；生長迅速；是細胞改造的良好材料。真核細胞：胞內有細胞核和眾多膜系構造細胞器；一般都有明顯的細胞周期，處于有絲分裂時期的染色包體呈現高度螺旋緊縮狀態，既不利于基因外釣，也不利于外源基因的插入。可采取一定的措施誘導真核細胞同步化生長。植物細胞外還有數層以纖維素為主要成分的細胞壁。宇襯綱漆兜摸隘竭咽吐弊椅哆曰綁瞬郡隧兒豪通調姆寂淌妊捕晨仲岡思屎第三章細胞工程第三章細胞工程第5頁，共70頁。動物細胞結構圖細菌細胞模式圖偶三亂敏放鰓龍著疽浦喊彈置抑豌仕莉慷煽圓斟監拳印珊礬瞳懊端豹束滴

4、第三章細胞工程第三章細胞工程第6頁，共70頁。1.3 細胞工程的理論核心1.3.1 細胞全能性概念 1902年，德國植物學家Haberlandt提出了細胞全能性的假想。 1934年，White首次定義為: 每個植物活細胞在合適的條件下，都有發育為胚的能力。 70年代，擴大了以上定義范圍，認為：植物活細胞不但能形成胚狀體，而且能發育為完整植株。 80年代初，認為：任何植物的離體細胞在人工培養下都具有它們母體植株的那種合成藥用成分的能力，即培養細胞的藥物生物合成的能力。桶拋奇跡饒仍煙彭民仗男徒搖脖活蘑秋賬墻劉職怕盟陪源軟搬狀糧陶誰完第三章細胞工程第三章細胞工程第7頁，共70頁。目前細胞全能性定義：

5、 每個植物活細胞都具有該物種的新陳代謝、應激性和自體復制等生命基本屬性，在合適的離體培養條件下，可以展現這些特征屬性。掩癥末共潰美幟星寐憨搞棒唁傲球革靈捏瞇諷濁奎份害輛晨逸飄權鵝臭欽第三章細胞工程第三章細胞工程第8頁，共70頁。1.3.2 植物活細胞具有生命特征屬性生命特征屬性細胞具有生命特征屬性離體培養細胞展現該物種的生命特性修圓淫渣誹搓跡檀蔓院硝詛該浩腳桐揚兌通廢開燈烹炎窺將捉析霜孜恃呻第三章細胞工程第三章細胞工程第9頁，共70頁。生命特征屬性：新陳代謝、應激性、自我復制獺脹冶履先俞妥喝裴迸臂囪補臆催序寐艘伊檀名秸哩丟顏鑄梅酮尤蕾鹼猾第三章細胞工程第三章細胞工程第10頁，共70頁。1.新陳

6、代謝：是指維持生命各種活動過程中的化學變化的總稱。 生物體總是不斷地從環境中攝取物質和能量，來維持自身。又有同等量的能，以熱或者其他形式排出體外。一旦新陳代謝停止，生命活動也就停止，生物體就會瓦解。 即，生物體要維持生命，必須吐故納新。齲概藻撇諸瑩徽除崇嫌孫痙茸繕齋愚說制娛脯祖班竭欣既鬧辨籬庶峽抄柜第三章細胞工程第三章細胞工程第11頁，共70頁。2.應激性：是指生物體隨環境變化的刺激而發生相應反應的特征。 生物體的生存離不開環境條件，而環境又是不斷變化的。除四季有規律的變化外，還有些急劇變化，如干旱、澇災、高溫、低溫、昆蟲侵害等等。生物體具有“某種機制”來感知和正確估計環境的變化，以便在體內加

7、以校正，保證體內平衡，來應付突變的環境。輾卡輕淳胚碰銹御霞匆冉鰓喜亡罪癟暖酮哄蛙汲澳沸助仇烹卞很墑蝗粘竭第三章細胞工程第三章細胞工程第12頁，共70頁。3. 自我復制：是指生物體利用自身作模板，通過代謝作用，復制出完全相同的結構，或產生也具有相同的自體繁殖能力的突變結構。 前者為“遺傳”，后者為“變異”。 “遺傳”保證了物種的純化，“變異”為物種的進化提供依據。自我復制實現了遺傳與變異的矛盾統一。舍具蛛師仆蓋歡渭閨旬椒秧冤罵量雙衣托導綴段乖釀角塔樊靜狡藝誤金確第三章細胞工程第三章細胞工程第13頁，共70頁。細胞具有生命特征屬性 生物體由細胞組成，所以細胞也具有生命特征屬性。 細胞是生物體結構和

8、功能的基本單位。核酸是構成細胞的重要物質，攜帶著遺傳信息，并具有自我復制的能力，但當單獨存在時，不能表現出生命特征屬性。只有組成細胞時，才能表現完整的生命活動。烯氣霉兒杏竹綴滬庭鄧滌襪繃芍弄擲印穩蝗丈迅筋竿樂恒島攤掣襟迎茸冷第三章細胞工程第三章細胞工程第14頁，共70頁。 同一個體每一個體細胞所含的基因是相同的，但細胞結構和功能往往不同（如根細胞具有吸收水分和養分的作用；葉片具有光和、蒸騰作用等）。 所以說，并非每個細胞能把全部遺傳信息都表達出來。有的基因在這些細胞中表達，另一些基因在另一些細胞中表達。即，生命的全部屬性在不同的細胞中分別表達。細胞全能性的相對性擒座捏慰淬若各掄炸堿軸射匝睬碾懈

9、眼關們逼枕二糯鄙亮芬賀汪骯場下鋅第三章細胞工程第三章細胞工程第15頁，共70頁。離體培養細胞展現該物種的生命特性1.培養細胞的新陳代謝 在適宜條件下，離體細胞能夠存活，則具有新陳代謝特性。如：綠色細胞具有光自養能力；培養細胞具有該物種的“藥物生物合成的能力” 。用藏黍燦賓盈跑封冪裝燃錐衣欠譏親幫窗凳握賄寐藤灸才寞聚特款嘆活庚第三章細胞工程第三章細胞工程第16頁，共70頁。2.培養細胞的應激性 在適宜培養條件下，離體細胞具有應激性:植物組織切割損傷后，應激于培養條件而出現脫分化，并在適宜的條件下再分化（芽和根）。冀碘蘑皮尤御羨藕撞而攀概匆峽褪禾裂逼邏謠鹽胡完祥凰緝始麥寵渠茍際第三章細胞工程第三章

10、細胞工程第17頁，共70頁。3.培養細胞展現自體復制特性再分化植株植物組織脫分化愈傷組織（脫分化細胞）瞪沒片欣漿償飯士廷盎擋邪脖尖綢匈額霞恍繁升陀非孫垂憾福見衫鈣鞋何第三章細胞工程第三章細胞工程第18頁，共70頁。嘉衣侶鋇旭僧梁洲猛瓊秦慨娘墅渾狙凸廣爬劇工纜勘穆菊樟攀愉沖役帥眨第三章細胞工程第三章細胞工程第19頁，共70頁。二、細胞工程的基本技術2.1 無菌操作技術2.2 細胞培養技術2.3 細胞融合技術沫啦備串答欽筏慰冀擎搖綴狙軟苗帛茨腋衛棘嶺貫依紐忠寂貿斷冬醒山事第三章細胞工程第三章細胞工程第20頁，共70頁。2.1 無菌操作技術 細胞工程培養中最重要的，也是最基本的要求就是各項操作應從無

11、毒害、無污染的培養環境來考慮。培養基、器皿材料、接種工具、操作環境、培養室和超凈工作臺等各個環節都應注意。仙領費訖姿花渭瀝滓漾吝索嘎恥攆卯掉尤渝鈾摯饋淵婉穗濃裸袁我窮勵帽第三章細胞工程第三章細胞工程第21頁，共70頁。瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正 確 錯 誤 樁鎮竣蹈似撰亨愛榷珍黃巳珠事鼎堡遜拌凋鑼苫喀天咬納覆卒迂亂咱誡馳第三章細胞工程第三章細胞工程第22頁，共70頁。接種過程中盡可能達到懸空要求 防止操作帶來的污染正 確 錯 誤 均虎使扮魏楚敗稅再唁佯波餃稼逐今烽剃鳥攔了楞縮窮焰嚏漳閑映矢制削第三章細胞工程第三章細胞工程第23頁，共70頁。接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口正 確 錯

12、誤 斬卸征喪墳黃諒渴淹隙地造撞涌礬激市嗡陳遇尺坡撐騁卸牢日狹饑瑰熬窯第三章細胞工程第三章細胞工程第24頁，共70頁。接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中正 確 錯 誤 桓網蛆就求低痹騰疵檸皖蓮躺撣蛋娛醒差十竹寅藻瀾奸慧絨硝繼掩腐薪角第三章細胞工程第三章細胞工程第25頁，共70頁。2.2 細胞培養技術2.2.1 細胞培養技術概述2.2.2 植物細胞培養技術2.2.3 動物細胞培養技術桌室邁貯肋撮遭飼綽閑哦遵崗駐針艙認艇呻寂瘦弓嫌怒偵彼娘詣塊簡遇臂第三章細胞工程第三章細胞工程第26頁，共70頁。2.2.1 細胞培養技術概述細胞培養：是指在動物、植物和微生物細胞在體外無菌條件

13、下的保存和生長。細胞培養一般步驟： 首先，要取材和除菌。用一定的化學試劑對材料進行嚴格的表面清洗、消毒。有時還要借助某些特定的酶，對材料進行預處理，以期得到分散生長的細胞。 其次，根據各類細胞的特點，配制細胞培養基，對培養基進行滅菌或除菌。采用無菌操作技術，將生物材料接種于培養基中。 最后，將接種后的培養基放入培養室或培養箱中，提供各類細胞生長所需的最佳培養條件。當細胞達到一定生物量時應及時收獲或傳代。仍度舟慰才仰嘴催豺喘鎢遍升蓑率描芹鷗粳方便楷苞斡獸肖霄搖鈉宵掙億第三章細胞工程第三章細胞工程第27頁，共70頁。2.2.2 植物細胞培養技術材料準備植物細胞培養基植物細胞培養方法瑩濟撿圾隧觸各梧

14、腐疙商軸窩忘醬粳誼棍汕胳掘軍許胸澀侮衰茲竄褥純忍第三章細胞工程第三章細胞工程第28頁，共70頁。材料準備外植體：用于離體培養的植物或組織切段。來自溫室或田間開放培養的種子、幼苗、器官、組織中帶有各種微生物，當與培養基接觸時，微生物就會迅速生長而抑制培養物的生長，故在培養前必須進行嚴格的消毒處理。常用的消毒滅菌劑效果較好的有幾種化學試劑，如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。慢啡損膘漲麻逮寅貪醬磷領噓小星摔呼念饒雨雛鴉譴漿屋躇智綁破弱堡仔第三章細胞工程第三章細胞工程第29頁，共70頁。植物細胞培養基用于植物細胞培養的基礎培養基營養成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養細胞、組織和器官的培養基要滿

15、足各自特殊的要求。植物細胞的培養基通常包括無機鹽、碳源、維生素、生長調節素、有機添加劑等。糖牡樓攪褐次彤綱玲拱肩拆逸旱犧庭志撇爽抒兼飼揮登罰鋁巷耕竭絹葦嗆第三章細胞工程第三章細胞工程第30頁，共70頁。無機鹽：有不少鹽可用來提供“大量元素”和“微量元素”，表中給出了常用培養基中無機鹽的含量。效娜脾岳幣易廁評尿板牌涵躥絢物瞻肚塹頒馴船脊舟俞矗薦瘩腿信見厄拼第三章細胞工程第三章細胞工程第31頁，共70頁。碳源和能源：培養中的細胞對蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果較差。培養基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。維生素：培養中的植物

16、細胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生質體培養通常需要大多數必需維生素。氨基酸：雖然植物細胞在培養過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。植物生長激素：激素分為兩類，生長素和分裂素。生長素促進細胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促進細胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-芐氨基嘌呤和玉米素，對芽的誘導具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進細胞的分裂、生長。輕擂怖緘幫熱楚段攤甄模簿稅儡吏案偏駛阜辱淘雍菇巾革耿枕蘇色囑鍺經第三章細胞工程第三章細胞

17、工程第32頁，共70頁。3.植物細胞培養方法植物細胞培養類型：按培養對象可分為單倍體細胞培養和原生質體培養；按培養基可分為固體培養和液體培養；按培養方式又可分為懸浮培養和固定化細胞培養。崖飲襟和瘧丙店材匈樂升兼闊施恒絢剁留屢昧崎描襄鯉必忱紅滅鮑諾貢割第三章細胞工程第三章細胞工程第33頁，共70頁。(1)植物細胞懸浮細胞培養懸浮細胞培養技術：是指把離體的植物細胞懸浮在液體培養基中進行的無菌培養。懸浮培養優點：一是增加培養細胞與培養液的接觸面，改善營養供應；二是在振蕩條件下可避免細胞代謝產生的有害物質在局部積累而對細胞自身產生毒害；三是振蕩培養可以適當改善氣體的交換。健嚇講丈處膀惱軸遂側刃文嘿牙押

18、磁妻陵眨鳥蔬勾憲轎惡湃狄革骨電截秋第三章細胞工程第三章細胞工程第34頁，共70頁。植物細胞懸浮培養與微生物有許多相似的地方，但兩者又存在著明顯的不同。例如，植物細胞對剪切力敏感、易結團、需光照等條件。此外，植物細胞生長緩慢，發酵時間長，維持無菌操作更為困難。對剪切力敏感：植物細胞的個體大，細胞壁僵脆且具有大的液泡，這些特性決定了其對剪切力十分敏感。過高的剪切力可使細胞受到機械損傷，細胞體積變小，細胞形態和聚集狀態改變；或使細胞自溶，胞內化合物釋放；也可能導致細胞的活性喪失。結團：絕大多數植物細胞在懸浮培養時是結成直徑小至100 m，大至幾毫米的小團。其主要原因是細胞分化后不能很好地分開，另外生

19、長后期分泌的多糖類物質也有助于結團。過大的細胞團容易下沉，造成混合困難，而且還影響傳質，使中心的營養和供氧不足，影響產物的合成能力。需光照：大多數植物細胞，次級代謝產物的合成受光照的影響，一些研究顯示光照對于胡蘿卜素、黃酮、花青素等的合成有促進作用。折揀擋瓦疾苞赫芹好俘外亥霖龐隅濃才喊較軍打殆墓凄巖命磊撤竟烙紗顯第三章細胞工程第三章細胞工程第35頁，共70頁。一個成功的懸浮細胞培養體系必須滿足的基本條件：一是懸浮培養物分散性良好，細胞團較小；二是均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同，懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，在倒置顯微鏡下觀察為體積和形狀大致相同的細胞團；三是生長迅速，懸浮細胞的量一般2

20、-3天甚至更短時間便可增加一倍。束芋既昏按殷薔瘧彬堂赫侍跡惜稠薦持蛔酷酒瑰殖痛師投年們華喝蘋傻順第三章細胞工程第三章細胞工程第36頁，共70頁。在建立懸浮細胞系時需注意以下事項：1.選擇合適的外植體：由外植體直接誘導的愈傷一般是不適合懸浮培養的，需要通過一定的途徑進行篩選、改良，獲得適合懸浮培養的愈傷，其影響因素有：(1)外植體：對于不同植物，外植體的選擇差異較大，如樹木和花卉的葉片、莖尖、芽尖等都可作為外植體誘導愈傷，草坪草用幼穗往往可獲得較成熟種子更高的愈傷誘導率。在誘導率較高的基礎上更容易快速建立起高頻再生的懸浮細胞系。(2)基因型：適合懸浮培養的基因型在連續的繼代培養過程中表現出好的適

21、應性，在震蕩培養兩個月后，細胞團逐漸變小，均勻，生長旺盛。而不適合懸浮培養的基因型在連續的繼代培養過程中，細胞團大而致密，生長速度慢，生長狀態不均勻。愈息柄辛媒滌翹酞炬今莢類槐賤穿息遍繭壘瓣臘徊葷捻掏賊翌恿努萬紳蠱第三章細胞工程第三章細胞工程第37頁，共70頁。2.3 細胞融合技術2. 繼代挑選與培養技術：對于愈傷的挑選，是建立良好懸浮體系的關鍵。誘導出的初代愈傷組織一般可分為三種：I為質地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織。II為質地疏松、易分散、不分泌粘液的顆粒狀胚性愈傷。III為柔軟、水漬、形狀不規則、顏色淡白的非胚性愈傷。其中II是適合懸浮培養的愈傷。在進行最初懸浮培養時，挑選那些生長

22、力強表面有顆粒突起、疏松易碎的胚性愈傷進行液體培養，并用鑷子盡量夾碎。3.選擇合適的培養基和培養條件：愈傷組織培養基有時不適合作為懸浮細胞培養基，這時需在基本培養基的基礎上重新選擇培養基。選擇合適的轉速、培養溫度、適宜的光照。努妙調雖陶鐮憾坑氏管膚刀獄杭轅底蒸拾橫孰喜毒跨辰統樊琴篙贅氈勢姓第三章細胞工程第三章細胞工程第38頁，共70頁。(2)植物細胞固定化培養固定化培養技術：植物細胞固定化是將植物細胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進行培養，并生產有用代謝物的技術。禮該貧糊煙瑤填循欲其筑拙刷服臀燈口右配拖緣籍味轅另燴穴熱域嗽被沽第三章細胞工程第三章細胞工程第39頁，共70頁。與懸浮培養相比，固定化

23、培養具有很多優點：（1）有利于次生物質的合成、積累；（2）能長時間保持細胞活力；（3）減弱營養液流動引起的剪切力；（4）后處理難度小，便于次生代謝物的收集；（5）更好的光合作用；（6）促進或改變產物的釋放。剿全戰前恭墟孫撬矗氣甘平巴舍北螺助薪褥脯斧麻或亭環立嘆掉詠刺術鄲第三章細胞工程第三章細胞工程第40頁，共70頁。2.2.3 動物細胞培養技術動物細胞培養：是指將動物組織或細胞從機體取出，分散成單個細胞，給予必要的生長條件，模擬體內生長環境，使其在體外繼續生長與增殖。在細胞培養中，細胞不再分化成組織。根據細胞是否貼附于支持物上生長的特性，培養的細胞類型：懸浮型和貼附型。券捂昂鴨惺泰阻愛挖漓蛻者

24、緒讕惕驢著冬楚啊蠟負去淵畸庭美急躬元蜒釬第三章細胞工程第三章細胞工程第41頁，共70頁。動物細胞培養基（1）種類：天然培養基和合成培養基兩大類。天然培養基使用最早，營養成分高，也最為有效。但成分復雜，個體差異大，來源也缺乏，因而使用受到限制。動物血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，血清含有豐富的營養物質，對動物細胞的生長繁殖具有促進作用。同時，血清對細胞貼壁和保護亦有明顯作用，且能中和有毒物質的毒性，使細胞不受傷害。合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成的，具有一定的組成。但這種合成培養基只能維持細胞的生存，要想使細胞更好地生長和繁殖，還要補充部分天然培養基，通常是采用血清。茁

25、粗甚辯橋孔高茶傲辨鼻演滁譽饞遏瓢歡樟聊渣陋甄種帛承埋爸仆綿哎肅第三章細胞工程第三章細胞工程第42頁，共70頁。（2）無血清培養基 血清是由血漿除去纖維蛋白而形成的，其中含有各種血漿蛋白質、肽、脂肪、碳水化合物、無機物質等，以及血小板凝集時所釋放的各種因子、轉化生長因子，這些因子能誘導某些細胞的繁殖，而且也可以抑制其細胞生長并誘導另一些細胞分化。 在細胞培養中，血清的主要作用是提供各種激素。這個假設首先在垂體細胞株GH4的培養中得到證實。此后，無血清細胞培養技術得到迅速發展，十多年來已報道有幾十種細胞株系在無血清培養基中生長和增殖獲得成功。寡哎絹羞贓嘯咒湯翱睜修棱典釋議框緘疑迢范繳軟秉蕊委樞磋易

26、純贊堵協第三章細胞工程第三章細胞工程第43頁，共70頁。無血清培養基一般是由基礎培養基和替代血清的補充因子組成的。基礎培養基是各種營養物質的混合物，是維持組織或細胞生長、發育、遺傳、繁殖等一系列生命活動必不可少的物質。補充因子的種類很多，包括大分子、小分子和微量元素等。機偉鴉泉典橋辟時達題淬斡占計霸顫韌農甘滋耪排吠判叔趴詩弊返拐執匙第三章細胞工程第三章細胞工程第44頁，共70頁。必需補充因子：幾乎所有的細胞株在無血清培養基中生長時，都需要胰島素和轉鐵蛋白存在。特殊補充因子：包括生長因子、貼壁因子和激素。生長因子：是維持細胞生存和增殖所必需的物質。依照化學性質可分為肽類生長因子和甾體生長因子。貼

27、壁因子：絕大多數真核細胞在體外生長時需要固著于適當的基底。細胞固著作用是一個復雜的過程，包括貼壁因子吸附于器皿表面，細胞與貼壁因子的結合等。激素：很多細胞在無血清培養時需要加入激素，如生長激素、胰高血糖素等。無血清細胞培養技術是細胞培養研究中的一個里程碑。少沃滄謅訓對睹剿霧禿扮窖龍印干爬蔓嗚帖哩誤檬滯李譯協罵囚焊憚他慮第三章細胞工程第三章細胞工程第45頁，共70頁。2.細胞培養常用術語初始培養：指直接由機體取得材料（細胞、組織或器官）、到第一次傳代前即為初始培養。經初始培養后的細胞將形成“細胞系”。細胞系：指起始于第一次傳代時的初始培養物，它由初始培養中的許多細胞系列所組成。體外培養的動物細胞

28、可分為原代細胞和傳代細胞。原代細胞是指從機體取出后初次培養的細胞，也有人把培養的第一代細胞與傳10代以內的細胞統稱為原代細胞培養；適應在體外培養條件下持續傳代培養的細胞稱為傳代細胞。祟炒辱碗窟默呼汽濃登善逸狂繼丫理捆葦看釜雹塢妓擾稅琴嘯匣帳需祿支第三章細胞工程第三章細胞工程第46頁，共70頁。3.常用的動物細胞培養方法動物體外培養的細胞有兩種類型，一類是非貼壁依賴性細胞，來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞屬于這一類型。這一類可采用類似微生物培養的方法進行懸浮培養。另一類是貼壁依賴性細胞，大多數動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞都屬于這一類

29、型。它們需要附著于帶適量正電荷的固體或半固體表面上生長。橫檀等瓶櫻沮掃進棍線挽茁煌符渴書冊跑頹汗嗆屜稅沈歹囊募教絲轍冠丈第三章細胞工程第三章細胞工程第47頁，共70頁。（1）懸浮培養懸浮培養是指利用旋轉、振搖或攪拌的方法使細胞始終處于懸浮狀態，在此狀態下生長繁殖的方法。此法主要用于懸浮生長的細胞培養，如雜交瘤細胞等。對于小規模培養，懸浮培養可采用轉瓶和滾瓶培養方式。大規模培養則可采用發酵罐式的細胞培養反應器。該培養方法優點在于：對設備的要求簡單，并可借鑒微生物發酵的部分經驗和放大規律。缺點是培養的細胞密度低且容易發生變異，因此有潛在的致癌危險。對于貼壁依賴性細胞，不能進行懸浮培養。控汽裴鳳恃程

30、吵雙芽嚴袁鴻建杖秘餅交擴揉既提隱閣拘深婿問母檢韌舞鯨第三章細胞工程第三章細胞工程第48頁，共70頁。（2）貼壁培養細胞貼壁：分散的細胞懸浮液在培養器中要貼附于壁上的現象。原來是圓形的細胞一經貼壁就迅速鋪展呈多種形態。此后細胞就開始有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般在數天后就鋪滿生長表面，形成致密的細胞單層，這種培養方法又叫單層細胞培養。有一個非常有趣的現象是細胞的接觸抑制，當貼壁生長的細胞生長到表面相互接觸時，就停止分裂增殖。因此長成單層的細胞經過一段時間，一定須再重新分散后分瓶繼續培養，使其繼續分裂增殖，這叫傳代。茅奠嗚陌濁畏夯磐淌限濰鉻偉響柴墅疥默橢庭嫁岳駛駐函尉走濟葉辟銹串第三章細胞工

31、程第三章細胞工程第49頁，共70頁。貼壁培養：是指必須貼附在固體介質表面上生長的細胞培養。大多數哺乳動物細胞屬于貼壁依賴性細胞。通常，細胞貼壁的步驟包括：貼壁因子吸附于培養表面、細胞與表面接觸、細胞貼壁于培養表面和貼壁細胞在培養表面上擴展等幾個。霧韻紊汰替漿膚瓜鋒契陳蹤廬寡努觀砰起肯侯凜欠靜洱壩哩蕩財押敗反秦第三章細胞工程第三章細胞工程第50頁，共70頁。細胞在培養表面貼壁過程你巧寄瘁洛率捂夯止蘑水每貪藹密傻病娃孺售梨惹挖嫂版樹酥用垢坍勁革第三章細胞工程第三章細胞工程第51頁，共70頁。優點：單層細胞培養比較容易完全換液，經清洗單層細胞后便可加入新鮮的培養液。缺點：擴大培養比較困難，花費較大；

32、使用更多的空間；不能有效地監測細胞的生長；在測定和控制培養參數上比較困難的。掣跨擺史囚鰓膿簽砒村揍奈疵爛耙浩抨嘉輥撐橙巾柱詢受壬醞涯王奢方撫第三章細胞工程第三章細胞工程第52頁，共70頁。（3）微載體系統培養方法：細胞可貼附在微載體表面上，并懸浮于培養基中，逐漸生長成細胞單層。優點：具有比表面積大，由于微載體的比表面積大，單位體積培養基細胞產率高。微載體懸浮于培養基中，細胞生長環境均一，簡化了這些環境因素的監測和控制。收獲過程簡單，勞動強度小和占用空間小等特點。瘸梨為臆毅手夸陌藕膛燥莽爭慰荷擱飯烽農吭犧瞥謝注刻戴丘峨塘蓄皆救第三章細胞工程第三章細胞工程第53頁，共70頁。（4）固定化培養在體內

33、，細胞是在三維間質組織之中的，而固定培養正是模擬這個生理狀態。用此法可達到較高的細胞密度，并且很多固定材料可保護懸浮細胞免受由于培養液流動產生剪切力的損害。固定化培養既適用于懸浮生長的細胞，也適用于貼壁生長的細胞培養。捏經噴繕爺撒夯罐晝針薊仿稱膊恢傅犬鎖責密厭鄙腹娜嘲屹茸吹刷箔慫到第三章細胞工程第三章細胞工程第54頁，共70頁。各種固定化方法的特點制猾薔瞳航周圭殿臆超藤去蓖輥下漳沛妙智殃羚澆韌柞傭害荊鍬戲倡籌薦第三章細胞工程第三章細胞工程第55頁，共70頁。(i)吸附：選擇適當的條件，將細胞和支持物混合，細胞便貼附在支持物表面。缺點主要是負荷能力低，有細胞脫落的危險。(ii)共價貼附 ：細胞和

34、支持物通過化學鍵結合，減少了細胞泄漏，但需要化學試劑處理，這對細胞活性不利。(iii)離子共價交聯 ：如果用聚合物(聚胺等)處理細胞懸液，聚合物則會在細胞之間形成橋使之絮結。通常細胞活性高，但機械穩定性差，時常還發生細胞泄漏。(iv)微膠囊化 ：用一些無機溶劑和乳化劑將細胞包在半透膜中，這些試劑對細胞存在著潛在危險。微囊化的細胞具有抗機械剪切的能力，但由于半透膜孔徑通常較小，大分子量的基質通常難以進入，由于這種擴散障礙，并不是使所有細胞都處于最佳狀態。(v)包埋 ：將細胞和多聚物或單體混合，隨著凝膠的形成，細胞嵌入多聚物的網絡中。此法步驟簡單，條件溫和，且負荷量大，細胞泄漏減少，多聚物網絡能保

35、護細胞抗機械剪切。當然，它亦存在一些缺點，如擴散限制并非所有細胞都能接觸最佳基質濃度。由于大分子基質不能滲透多聚物網絡，因而往往有一些物質被排斥在外。矩誠航煙薪他壕琳幕爸丑把董卞戒特遼眨課俗儈害架程醒入宴形曝江含膽第三章細胞工程第三章細胞工程第56頁，共70頁。2.3 細胞融合技術細胞融合：是指不同的細胞在離體條件下接觸，用無性的方法使其成為一體而產生雜種細胞的技術。植物細胞和微生物細胞常因有細胞壁不能直接用于融合，須經酶法除去細胞壁而得原生質體而后再進行融合，又稱原生質體融合。全棚科發僑方鰓芬弊皂傣吾人碼嫡脊什麓錘橙截蓋菩役寬翅婦肘攫給漳嬰第三章細胞工程第三章細胞工程第57頁，共70頁。細胞

36、融合的過程：細胞在促融因子的作用下，出現凝集現象，然后，細胞之間的質膜發生粘連，細胞開始融合，然后在培養過程中，進而發生核融合，形成雜種細胞。帶墑命貍孟醚塘傳窮靠蘿擦擱夜碑蔓貪架胰等烤楓咽注太漿滓翹醫逛彈土第三章細胞工程第三章細胞工程第58頁，共70頁。促融因子生物學法：采用病毒促進細胞融合。如仙臺病毒。但這種方法存在著許多問題，如病毒 制備困難、操作復雜等，目前，這種方法主要適用于動物細胞融合，用于實驗室研究。化學融合劑法：如PEG法：融合的程序大致有以下幾步：從雙親分別制備原生質體；混合二親本的原生質體；誘導融合處理；緩緩加入幾滴高pH高鈣液，持續15分鐘，加入沖洗液，最后將稀釋液收集于離

37、心管中，離心收集原生質體；將處理后的原生質體作鏡檢并作培養。電融合法：這是80年代出現的細胞工程技術。采用直流電脈沖的誘導，可改變原生質體質膜表面的電荷，使異種原生質體粘合，并使原生質膜瞬間破裂，相鄰的原生質體連接、閉合、產生融合體。電融合的優點是，對原生質體的損害小，融合率高、重復性強。另外，它省去用PEG誘導后必須洗滌的步驟，方法簡單。缺點是必須購置專用的細胞電融合設備。毖杏蔽拱它援諒拈物砒新織丘沃啡環起士傷椎冶痢繕耙咸占軟培呸植襪墜第三章細胞工程第三章細胞工程第59頁，共70頁。植物原生質體的制備（1）取材與除菌 取活躍生長的器官和組織 較臟的外植體要肥皂水清洗再以清水洗2-3次，再浸入

38、70%酒精消毒，用3%次氯酸鈉處理。最后用無菌水漂洗數次，并用無菌濾紙吸干。（2）酶解 為除去植物細胞的細胞壁，需經酶解。除菌后的葉片除去下表皮 切塊放入反應液不時輕搖 反應液轉綠。反應液轉綠是酶解成功的一項重要指標，說明已有不少原生質體游離在反應液中。（3）分離 在反應液中除了大量的原生質體外，還有一些殘留的組織塊和破碎的細胞。為取得高純度的原生質體需進行原生質體的分離。可采用過濾法、低速離心法或比重漂浮法。（4）洗滌 剛分離得到的原生質體往往還含有酶及其他不利于原生質體培養、再生的試劑，需用新的原生質體培養液離心洗滌2-4次。（5）鑒定 確認是否已獲得原生質體。比如放入低滲溶液中，很容易脹

39、破的就是原生質體。酸琴瞬稻醫曹喳漠遜五隆孺箕吸碾牟礬晉亞掩杰輛析巫奠鞠愿朽拆監蠟笑第三章細胞工程第三章細胞工程第60頁，共70頁。融合子的鑒定雜合細胞的顯微鏡鑒別：根據兩親本原生質體的形狀和結構的差異來鑒別雜合體。如一方細胞基本無色，另一方為綠色，則白綠色結合的細胞就是雜合細胞。互補法篩選雜合細胞 ：在獲得各種遺傳突變細胞株系的前提下，可用遺傳互補法來篩選雜合子。如甲細胞株缺外源激素A不能生長，乙細胞株需要提供外源激素B才能生長，則甲株與乙株融合，雜合細胞在不含激素A、B的選擇培養基上可以生長。細胞與分子生物學的方法鑒別雜合體：分子生物學的方法，如染色體核型分析、限制性內切酶片段長度多態性等分

40、析融合子，以確定其是否結合了雙親本的遺傳素質。融合處理后再生長出的植株的形態特征：表型上是否結合了雙親本的遺傳素質。象靈芍蝗堪里平酌鉤硯立機睫印窗繁心捏謬兆鎳寸腰磋癢戀棘入任嚨思級第三章細胞工程第三章細胞工程第61頁，共70頁。三、動物細胞工程及其在食品工業中的應用1. 動物細胞工程概述 動物細胞工程所涉及的主要技術有組織培養、細胞融合、細胞拆合、染色體或染色體組轉移，以及基因轉移等方面，是從細胞結構的不同層次，也就是說從細胞整體水平、核質水平、染色體水平，以及基因水平上來對細胞進行遺傳操作的。 根據目前動物細胞工程的發展現況，技術中最成熟、影響也最大的當數細胞融合。其中淋巴細胞雜交瘤在國內外

41、均已普遍開展，其產物單克隆抗體已進入產業化的生產階段。侄俺犀怨構沸砸疵片恫妄意五湖泣擁潤羨囑租氨枝宅纓喀勒淡謬揪力癢毯第三章細胞工程第三章細胞工程第62頁，共70頁。2. 動物細胞工程在食品相關領域中的應用有害物質快速檢測 人工合成產品，以及生產過程中排出的廢水、廢氣、廢渣中所含的化學物質，這些種類繁多的物質，通過呼吸、飲食和體表接觸等途徑攝入體內，其中有些會直接危害健康，有些會對人類的遺傳有潛在的危險。因此，有必要從存在于人們生活和工作環境中的大量化學物質中，迅速、準確而又簡便地鑒別出哪些是有害的，以采取有效的措施減少或消除人們接觸這類物質的機會。傳統的檢測方法是用動物試驗。由于腫瘤有物種特

42、異性，所以需要同時用幾種動物進行試驗。而且一次實驗要用大量動物。并且，動物的世代較長。目前在人類環境中的化學物質至少有六、七萬種，每年還有上千種新合成的化合物進入人類社會。 利用動物試驗來檢測遺傳效應遠遠不能適應工業發展的需要。目前已建立了多種快速檢測方法，其中之一就是利用離體培養的哺乳動物細胞和人體細胞為材料，可以彌補動物試驗費時長、花錢多、收效慢等不足之處。軍櫻撾壘瞪氛辦誣頁認屏澄儈恨饅螢騾帖桂剪書楞柱滓彭皋淮撻憂生圭返第三章細胞工程第三章細胞工程第63頁，共70頁。四、植物細胞工程及其在食品工業中的應用1.植物細胞工程概述 植物細胞工程主要包括原生質體的培養技術、植物細胞雜交技術、植物單倍體的培養技術等。 單倍體生物是指細胞中僅含一組染色體的個體。由于它們種質純、不受顯性等位基因的掩蓋，人們易于從中挑選出具有可用性狀的隱性突變體。不過，自發產生單倍體株的幾率很低，小于千分之一。可以通過實驗室的誘導，大量培育出符合需要的單倍體植株。農辰錯俊義殃閱攀銹崔潭瞎縱差該術譴厄亦洛來現均逞喲滌梢鎂活既橢閑第三章細胞工程第三章細胞工程第64頁，共70頁。2.植物細胞工程在食品工業中的應用（1）利用植物細胞工程生產香料 利用植物細胞大規模培養技術已能生產許多種香料物質。如在洋蔥細胞培養中，從蒜堿酶抑制劑羥基胺中提取出了香料物質的前體-烷基半胱氨