1、專業資料血清清蛋白、Y -球蛋白的分離、提純與鑒定一、實驗目的1,掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋白質的原理和基本方法；.掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法；, 了解柱層析技術。二、實驗原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白組成，各行使其重要的功能。本實驗利用鹽析方法將血清中的清蛋白和球蛋白分離，并用電泳技術觀察蛋白質分 離教果。.鹽析蛋白質分子能穩定存在于水溶液中是因為有兩個穩定因素：表面的電荷和水化膜。當維持蛋白質的穩定因素破壞時，蛋白質分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白質分子沉淀 析出的方法很多，根據對蛋白質穩定因素破壞的不同有中性鹽析法、有機溶溶劑法、重 金屬鹽法以及生物堿試劑

2、法等。 鹽析法的原理是：中性鹽如硫酸俊(NH 42SO4)等對蛋 白質作用破壞了蛋白質表面水化膜，并且中和了部分電荷，從而使蛋白質相互聚集而析 出。由于血清中各種蛋白質分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析 所需的鹽濃度也不同，因此調節鹽的濃度可使不同的蛋白質沉淀從而達到分離的目的。血清球蛋白在半飽和狀態下發生沉淀，而血清清蛋白在完全飽和狀態下沉淀，利用此特性可把蛋白質分段沉淀下來，即在半飽和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，離心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸儲水即可溶解，由此達到分離清蛋白和 白蛋白的目的。.脫鹽下載可編輯WORD完美格式專業資料鹽析得到的蛋白質含

3、有高濃度中性鹽，需要有脫鹽過程去除蛋白質遺留的中性鹽， 常用方法有：透析法脫鹽和凝膠層析法脫鹽。本實驗采用凝膠層析法脫鹽，在葡聚糖凝 膠柱中，蛋白質與鹽的分子量不同，當樣品通過層析柱時，分子量較大的蛋白質因為不 能通過網孔而進入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動，所以流程較短，向前移動速 度較快，最先流出層析柱；反之，鹽的分子量較小，可通過網孔而進入凝膠顆粒，所以 流程長，向前移動速度較慢，流出層析柱的時間較后。分段收集蛋白質洗脫液，即可得 到脫鹽的蛋白質。.純化（離子交換層析）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負電荷的交換劑稱為陽

4、離子交換劑。本實驗采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負電荷的離子可與其進 行交換結合，帶正電荷的點正電荷的離子則不能，這樣便可達到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點的不同可進行分離。血清中各種蛋白質的pl各不相同，因此，在同一醋酸俊緩沖液中，各蛋白質所帶的電荷 不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和伽馬球蛋白分離出來。.純度鑒定（電泳）血清中各種蛋白質的等電點不同，一般都低于pH7.40它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血漿中各種蛋白質分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，因而在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不

5、同。因此可以將它們分離為消蛋白（Albumin）、a-球蛋白、a 2球蛋白、&球蛋白、丁球蛋白5條區帶。三、材料與方法：以流程圖示意.實驗材料人血清、葡聚糖凝膠 G-25（Sephadex G-25）層析柱、二乙基氨基乙基（DEAE）纖維素離子WORD完美格式下載可編輯專業資料交換層析柱、飽和硫酸俊溶液、0.3mol/l的PH6.5醋酸俊緩沖液、0.06mol/l的PH6.5醋酸俊緩沖液、0.02mol/l的PH6.5醋酸俊緩沖液、1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4AC溶液、20%磺基水楊酸、1%BaCl2溶液、電泳儀、電泳槽。.實驗方法1)實驗流程2)實驗步驟鹽析：中性鹽沉淀步

6、驟步驟操作(1)鹽析取離心管一個，加入0.8mol人或動物血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸俊溶液 0.8ml,混勻后室溫下放置10min,離心10min(4000r/min)。用滴管小心吸出上精液置丁試管中，作為純化清蛋白之用(2)溶解沉淀何離心管的沉淀加入0.6mol蒸儲水，振搖使之溶解，作為純化丫球蛋白用注意：上層清夜盡量全部吸出，但不可吸出沉淀物脫鹽：過凝膠層析柱步驟下載可編輯WORD完美格式專業資料步驟操作(1)調節層析柱液向葡錮糖凝膠G-25層析柱經0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗平衡后，M包壓儲液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夾，使層析柱上的緩沖液面剛好卜降到凝膠尿液向

7、(2)加樣品用細長滴管吸取上述經鹽析所得的粗制蛋白質溶液，小心而緩慢的加入凝膠床上面，柱下端用 10ml刻度離心管接液，擰松柱下螺旋夾，調節適當流速，使樣品進入凝膠床，至液面降到凝膠床表面為止(3)洗層析柱小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌層析柱內壁，以洗滌粘在柱壁上的蛋白質樣品液(4)洗脫待樣品液進入凝膠床內，繼續用 0.02mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗，同時注意流出液量下載可編輯WORD完美格式專業資料(5)檢測及收集在黑色反應板凹孔內加2滴0.92mol/L磺基水楊酸，隨時檢查蛋白質流出液是否含有蛋白質，滴流出液1滴黑色反應板凹孔內接觸到磺基水楊酸

8、溶液，若出先白色混濁或沉淀，表示已有蛋白質流出(當凝膠床體積為5.5ml時，流出的液體量約為2ml就可能有蛋白質流出)，立即收集流出的蛋白質溶液。收集約12滴后，滴流出液1滴于預先加有1滴0.05mol/L(1%)BaCl2的黑色反應板 凹孔內，一旦見出現白色沉淀(表示有SO?),立即停止收集收集的蛋白質溶液即可分別過 DEAE纖維素柱，進行離子交換層 析(6)層析柱再生平 收集蛋白質溶液后的凝膠層析柱繼續用0.02mol/L pH6.5 NH4AC衡緩沖液流洗，用BaCl2液檢測層析柱流出液，當流出液用BaCl2檢查SO廣為陰性后，繼續洗滌23ml。凝膠層析柱即可再生平衡， 可再次使用注意：

9、a.當層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時，不要使液面低于 纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測蛋白質的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋼混淆，因為二者相應生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應注意及時收集樣品，切勿使蛋白質峰溶液流失。e.葡萄糖凝膠價錢昂貴，要回收再生避免損耗, 嚴禁倒掉。 球蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱下載可編輯WORD完美格式專業資料步驟操作(1)調節層析柱換沖液向經處理再生好的DEAE纖維素層析柱，取下其恒壓儲液瓶 管塞。小心控制柱下端螺旋夾，使柱

10、上緩沖液面剛好卜降到 纖維素床表面。柱下端用10ml刻度離心管收集液體，以便 了解加樣后液體的流出量。(2)加樣品將除除鹽后收集的球蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調節層 析柱下端的螺旋夾使樣品進入纖維素柱床，至液面降到纖維 素柱床表面為止。(3)析層析小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸俊緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質樣品液。(4)洗脫待樣品進入纖維素柱床內，繼續用 0.02mol/L PH 6.5的醋酸俊緩沖液流洗，。同時注意流出液量(5)檢測及收集蛋白質流洗時，隨時用0.92mol/L磺基水楊酸檢查流出液中是否含 蛋白質(方法同前)當有蛋白質出現時，立即連續收集三管， 每管10

11、滴，。此不被DEAE纖維素吸附的蛋白質即為純化 的丫球蛋白，取其中蛋白質濃度戢高的一管留作鑒定用。注意：a.當層析柱的緩沖液面或樣品液面剛好下降到纖維素床表面時，不要使液面低于纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。C.切勿將檢測蛋白質的磺基水楊酸與檢查硫酸根的氯化鋼混淆，因為二者相應生成物的沉淀均為白色。d.洗脫是應注意及時收集樣品，切勿使蛋白質峰溶液流失，特別是收集伽馬球蛋白時。清蛋白的純化：過DEAE纖維素陰離子交換層析柱下載可編輯WORD完美格式專業資料步驟操作(1)調節層析柱緩沖液面此時DEAE纖維素

12、層析柱不必再生，巾接用于純化清蛋白小心控制住下端螺旋夾，使柱上緩沖液而W始下降到纖維素床表面，柱下端用10ml刻度離心管收集液體，以便了解加樣后液體流出量(2)加樣品將除鹽后收集的清蛋白溶液緩慢加到纖維素柱上，調節層析柱 下端的螺旋夾，使樣品進入纖維素柱床，至液面降到纖維素柱 床表面為止(3)洗層析柱將除鹽的粗制清蛋白溶液上柱后，改到0.06mol/L、pH6.5NH4AC緩沖液洗脫小心用1ml 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗滌沾在柱壁上的蛋白質樣品液(4)洗脫待樣品進入纖維素柱床內，繼續用 0.06mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液流洗。同時注意流出液量。流出約 6

13、ml (其中含e球蛋 白及伊球蛋白)后，將柱上的緩沖液向降至與纖維素表向平齊。改用0.3mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫(5)檢測及收集蛋白質用0.92mol/L(20%)磺基水楊酸檢查流出液是否含有蛋白質(方法同前)。由于純化的清蛋白仍然結合有少量膽色素等物質，故肉眼可見一層淺黃色的成分被 0.3mol/L、pH6.5 NH4AC緩沖液洗脫卜來，大約改用 0.3mol/L NH4AC緩沖液洗脫約 2.5ml時，即可在流出液中試出有蛋白質出現，立即連續收集2管，每管10滴，此即為純化的清蛋白液，留作純度鑒定用(6)纖維素生與平衡用過的DEAE纖維素層析柱，應重新再生平衡先用約6ml

14、 1.5mol/L NC的3mol/L NH4AC溶液流洗，再用0.02mol/L pH6.5 NH4AC液約10ml流洗平衡即可專業資料注意：a.當層析柱的緩沖頁面或樣品頁面剛好下降到纖維素膜表層時，不要是液面低于纖維素膜表面，以免空氣進入凝膠床。b.往層析住加樣品或緩沖液洗脫事，要小心緩慢 加入，不要將纖維素沖起或破壞纖維素床表面平整。 C.使用時切勿將各時段所用的溶液 濃度搞混。d.洗脫是應注意及時收集樣品，切勿使蛋白質峰溶液流失。純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳）步驟操作準備電泳槽準備：將電泳槽置于水平平臺上，兩側注入等量的巴比安緩沖溶液，使其在同一水平a,貝聞與支架距離22.5cm,用二

15、層濾紙或雙層紗布搭橋薄膜準備：將醋酸纖維薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄 膜一段1.5cm處用鉛筆輕輕畫條橫線為點樣線，末端用鉛筆 做記號。進入巴比妥溶液中直至浸潤完全。用銀子青青取出，粗 面朝上，平放在兩層干濾紙中間，輕輕拭去多余的緩沖液。點樣薄膜片置于干凈的玻璃或濾紙片上，粗面朝上，用玻片或載玻片一段的截面在盛有樣品的直接沾取 23微升待測品，讓后將樣品 與薄膜點樣先輕輕接觸，均勻分布在點樣線上，帶樣品滲入薄膜 后移開，四種樣品分別點樣。電泳將已點好的樣品薄膜放在鋪肩濾紙鹽橋的電泳槽上， 點樣面朝下，點樣端至陰極，輕輕拉平薄膜。平衡約 5min,使緩沖液滲透大道 平衡。接好電路，調

16、節電壓開始電泳。待各個樣品沒有變化停止 電泳，并輕輕取出。染色漂洗和鑒定將染色液倒入大培養皿中，電泳完畢后用銀子取出薄膜，直接浸入染色約5min。后將薄膜取出，漂洗至背景無色，觀察電泳情況WORD完美格式下載可編輯專業資料得出結論。四、結果與討論：結果：實驗數據、現象、圖譜；討論：以結果為基礎的邏輯推論，并得出結論。.實驗結果從電泳圖譜中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白質與血清的清蛋白電泳圖譜幾乎一致，可以確定管內的蛋白質為清蛋白，同理球蛋白管內的蛋白質為丫-球蛋白。.實驗討論1）血清電泳中個別電泳帶的兩條帶之間界限不明顯染色時，醋酸纖維薄膜不是一張一張放入染色液的，在染色固定前，薄

17、膜與薄膜之間重疊，造成薄膜上還未固定的血清蛋白彼此粘連。染色時間控制不合適。因為時間長，薄膜底色深不易脫去；時間短，著色淺不宜區分，或造成條帶染色不均；透明時間控制不合適，如在透明液中浸泡時間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。2）第一管血清蛋白電泳帶參差不齊薄膜表面吸干時吸的太干或吸的不完全。因為點樣時應將膜片表面多余的緩沖液用 濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進入薄 膜的網孔內，而造成電泳起始點參差不齊，影響分離效果；點樣不均勻。3）第一管血清蛋白中含有少量雜質致使電泳圖出現偏差。思考題.硫酸俊鹽析一步，為什么是0.8ml血清加0.8ml飽和硫酸錢?下載可編輯WORD完美格式專業資料血清球蛋白在半飽和硫酸俊溶液中發生沉淀， 而血清清蛋白在完全飽和硫酸俊溶液中沉淀，將血清和飽和硫酸俊等體積混合后，其狀態相當于在半飽和硫酸俊溶液中，在此狀態下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，因而可以將其分開。.為什么實驗中DEAE纖維素柱分離了球蛋白后不用再生，可直接用于純化清蛋白？ 因為丫球蛋白帶正電荷，不與DEAE結合，會從層析柱中首先洗脫出來，所以分離丫球蛋白后可直接用于純化清蛋白。.應用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定分離純化后的血清清蛋白和丫球蛋白的純度，根據什么來確定它是清蛋白還是丫球蛋白？判定它們純度白依據是什么？由于血漿中各種蛋白質分