1、成骨細胞的培養及骨折模型的制作成骨細胞的培養可廣泛應用于骨折及骨損傷的疾病研究中，同時為篩選新型藥物和研究機制提供離體研究。原代培養細胞株 成骨細胞的培養及檢測 原代培養成骨細胞的來源國內外文獻報道新生動物的顱骨或胚胎顱骨為成骨細胞的常用來源。有不少學者嘗試用新生大鼠的顱骨分離成骨細胞，結果表明所培養的成骨細胞具有典型的成骨細胞的形態特征、生物學活性及發生鈣化的功能。有學者研究兔蓋骨的成骨細胞增殖代謝及鈣化的能力發現，來自兔蓋骨的成骨細胞具有較高的增殖能力，但堿性磷酸酶的生成較低，而且兔蓋骨來源的成骨細胞在體外培養中可以形成有序的鈣化結節和羥基磷灰石(HA)結晶。小鼠原代培養1.取新生3d以內

2、BALB/c小鼠，斷頸處死后立即投入75%酒精中消毒5min。2.D-Hanks液漂洗后分離顱蓋骨，刮除骨膜和結締組織，DMEM清洗顱骨骨片并剪碎3.加入0.25%胰蛋白酶（含0.02EDTA），37恒溫消化20min，吸出消化液，之后1mg/1mlI型膠原酶37恒溫消化20min后離心（1000r/min，5min），棄上清液4.加入含15%血清的DMEN培養基，吹打骨片（力氣不要過大，但要吹打次數多一下，盡量使細胞從松解得骨片上脫落），將細胞懸液接種于培養瓶中，置于37 CO2恒溫孵育箱中培養。 傳代培養步驟1.棄除舊的培養液（可以吸，可以倒，倒的時候小心）2.用PBS沖洗一遍（加PBS清

3、洗或換液時，不要將細胞沖刷下來）3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在顯微鏡下觀察，細部變圓，間距增大時，可用手拍打瓶側壁與底壁，會發現細胞很快懸浮。4.加入含15%的牛血清培養液終止消化5.用吸管反復細心吹打瓶底，置離心管中后，可以用PBS或D-HANKS再吹打，可以反復幾次，目的是將細胞盡可能的洗刷干凈6.離心 大鼠成骨細胞的培養將SD 乳鼠置入75 %酒精中浸泡5min。于超凈 臺上取頂骨,放入PBS 皿中,刮除附著組織,待骨質發 白、透亮,再放入PBS 小瓶反復沖洗,換液3 次,以0.1 %II型膠原酶消化30min 后吸棄酶液,再以PBS 沖洗3 次 ，加入0. 1 % I

4、I型膠原酶,將骨剪成1mm2 大小,放置15min 后加入與酶液等量的含15 %小牛血清的DMEM 培養基,吸取上清液,以1 000r/ min 離心10min ,將下層液接種于50ml 培養瓶,離心液去上清后接種于25ml 培養瓶,分別加入上述培養基,置入37 、5 %CO2 、飽和濕度培養箱內。每2 日換液1 次,待細胞長滿后,用0. 25 %胰蛋白酶消化,按12 比例傳代。 1.成骨細胞的取材： 新生SD大鼠的乳鼠 新生24h-72h的乳鼠 2.將去除血管及結締組織的骨片放置在1mlPBS液體中（PBS不要放太多，否則延長剪碎時間），用剪刀剪成1*1mm的組織快，越小越好（越小越能消化完

5、全），一只乳鼠的頭蓋骨加胰酶2ml，37水浴中消化30min（目的是消化掉附著骨片上的結締組織），離心去酶，加入2ml膠原酶2，水浴中繼續消化1h（中間間隔晃動，使消化下來的膠原離開團塊溶于液體中）。如此消化下來的混懸液可能比較稠，可以加適量的PBS，盡量讓膠原溶于液體中，否則不利于離心細胞沉降到離心管的底壁。 3.培養基問題：低糖的DMEM培養基 4.培養瓶 培養瓶在接種前，使用1%多聚賴氨酸快速包被（具體方法：每個50ml培養瓶加3-4ml1%多聚賴氨酸，盡量是底壁均鋪滿液體，擰上蓋子，放置30min，倒掉1%多聚賴氨酸液體，用去離子水或PBS液沖洗兩遍）， 包被的培養瓶，細胞很容易貼壁

6、。 注意問題大鼠成骨細胞成骨細胞的鑒定形態學觀察堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase，ALP) 鈣化結節染色 細胞株 MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨細胞），MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14）MC3T3- E1 細胞體外培養成骨細胞的影響因素物理因素1 電離輻射單次低劑量輻射（40 cGy 以下）對大鼠成骨細胞樣細胞不會引起明顯的改變 ,而單次高劑量輻射（400 cGy）卻使克隆成骨細胞系MC3T3-E1 的ALP 活性增加.2 微重力目前認為失重條件下骨形成受到抑制是造成骨質脫鈣的主要原因，特別是成骨細胞數目的減少和活性的降低。 3 外力

7、Hasegawa 等將鼠成骨細胞培養在可變形塑料膜上，使膜均勻變形，發現機械拉伸能刺激成骨細胞增加DNA 合成， 適當的拉應變 刺激，可使培養的細胞中DNA 含量明顯增加，還可導致成骨細胞的增殖變快。 微量元素微量元素在骨的形成和生長分化過程中起著重要作用，微量元素缺乏可能使骨骼發育受到礙，甚至可能發生畸形，成骨細胞增殖分化的過程與某些微量元素有著密切的關系1 鋅鋅是人體所必需的微量元素，它參與了機體新陳代謝的各個方面。近年來的研究證實鋅與骨代謝及機能的關系非常密切，鋅缺乏會影響骨骼的生長發育，促進骨質疏松的發生與發展。體外實驗表明，鋅能夠促進大鼠成骨細胞的增殖及分化，促進MC3T3-E1 成

8、骨細胞蛋白質及DNA 的合成。而鋅缺乏則抑制大鼠成骨細胞的增殖分化；鋅濃度過高會對細胞產生毒性.2 鋁目前認為一些疾病如骨質疏松、骨軟化等與鋁中毒有關。鋁蓄積于骨骼，對骨骼和神經系統等產生危害。文獻報道低濃度鋁可刺激體外培養的成骨細胞的增殖和分化，鋁對成骨細胞的作用不受培養液中生長因子變化的影響。高劑量鋁可抑制成骨細胞的生長發育并對其產生一定的毒性作用3 氟氟 一方面 作為骨基質構成物參與骨形成過程，另一方面，過量的氟攝入可導致齒、骨等組織及器官的損害。體外研究則表明，氟通過對成骨細胞的有絲分裂的作用促使成骨細胞的生長速度加快、數量增多、功能增強。氟對成骨細胞的作用與鋁有所不同，需依賴于培養液

9、中部分生長因子，除去這些生長因子，可消除氟對成骨細胞的作用.其它 銅對骨骼的形成和維持很重要。缺銅骨質中膠原纖維合成受損，骨骼發育受限，結構疏松，長骨易碎，骨發育停止。 錳對粘多糖、溶膠原的合成和骨形成有特殊作用。 故補充錳對粘多糖的合成有利鎂、鈣等對體外培養SD大鼠顱蓋骨成骨細胞樣細胞的增殖分化都具有一個最佳峰值.生長因子1 骨形態發生蛋白（BMP） 1982 年，Urist 等人從牛骨中提純了牛的BMP, 并提出了誘導成骨的新概念。BMP 是一種多肽，具有高效的骨誘導能力，能夠促進未分化的間充質細胞和成骨細胞的前體細胞分化為成骨細胞；引導成骨細胞表型的表達等。體外實驗中，將BMP 與載體結

10、合臨床治療骨缺損已有許多成功例證.2 血小板衍生生長因子（PDGF）PDGF 是一種存在于多種組織中的促細胞有絲分裂的多肽生長因子，能刺激多種細胞分裂、增殖。有研究表明，PDGF促進雞胚顱骨和新生小鼠顱骨來源的骨細胞的增殖，并使膠原蛋白合成增加。3 成纖維細胞生長因子（FGF）骨組織內FGF 主要貯存在胞外基質中 是成骨樣細胞和骨細胞的強促分裂因子。研究顯示，FGF 能刺激成骨細胞內的DNA 合成，使成骨細胞內骨鈣素增加，加速骨的鈣化，使新骨形成。4 轉化生長因子-（TGF-）骨是TGF-最大的組織來源和儲存庫，成骨細胞是骨組織中合成TGF-的主要細胞。同時，在成骨細胞的細胞膜上有TGF-的特

11、異性受體，TGF-可作用于成骨細胞，調節其增殖和分化。體外研究表明，TGF-對成骨細胞的作用是非常復雜的。 激素1 生長激素（GH）GH 對骨有促生長作用 人類生長激素能夠增加人類骨髓基質細胞的膠原產物 2 雌激素（E）絕經后雌激素水平下降造成骨質疏松，提示了雌激素對成骨細胞的重要性。有研究發現，雌二醇（E2）可濃度依賴性的刺激人的類成骨細胞株TE85 細胞增殖促進細胞膠原蛋白及堿性磷酸酶和骨鈣素的合成。 3 甲狀腺激素 T3 可刺激骨鈣素和膠原的產生，還可通過成骨細胞增加生長因子和結合蛋白的合成和分泌1 鼠模型 鼠價格低廉、喂養方便、生長周期短，并且基因組圖譜詳盡，可以更好地研究骨修復分子機

12、制，是常用的骨折愈合動物模型。鼠的骺板終生存在，可用于制作嬰幼兒骨骺壞死的模型。并且鼠沒有嘔吐反射，在進行口服給藥并且需要定量的實驗中較為適用。 在大鼠脛骨 和股骨 上制備橫形骨折模型。這種模型可重復性高、操作簡便。骨折模型的建立2 犬模型 犬是制備骨折愈合模型最常用的動物 。 成年犬與人類骨骼相似程度最高，并且根據 檢測，犬的骨折強度也與人類相似 。另一方面，犬是雜食類動物，其消化系統與人相似，可進行口服給藥。 3 兔模型 兔性情溫順，便于飼養，耳緣靜脈便于取血，也是制備模型時較為常用的動物。兔的骨骼轉化速度快，約達到了人類的 3 倍， 因此可以在短期內觀察骨折愈合時骨組織的變化 但兔是草食

13、類動物，消化系統與人差異較大，不應用于骨折愈合的藥物治療實驗。 兔的后肢發達，股骨粗大，可用于股骨頭壞死的動物模型制備，也多用于疲勞性骨折的模型制備家兔骨折模型的復制將實驗動物用戊巴比妥鈉 耳緣靜脈麻醉，在無菌操作下, 取右撓骨中段背側縱行切2cm, 在肱撓肌鍵深面縱行切開骨膜約6cm,、環形剝離骨膜,用特制寬度為3mm 單葉手鋸, 將撓骨垂直鋸斷造成3mm缺損(分離移位, 對側骨膜完整)沖洗縫合骨膜皮膚. 大鼠骨缺損模型的建立：選用健康體重為25020gWistar大鼠 ，用3%戊巴比妥鈉30mg/Kg腹腔注射全麻，在無菌操作下，用12號針頭經皮鉆孔消弱右側脛骨皮質。經前正中做皮膚切口至近端脛骨結節，用9號針頭經相應的皮質插入髓腔，終于遠端脛骨生長板的近端。在預先消弱點做脛骨骨折。術后用1號線縫合皮膚，攝X線片證明固定和復位。麻醉清醒后，自由活動 骨質疏松模型的建立雌性SD大鼠 體重220260 g，分為