1、實驗六酵母RNA的提取、組分鑒定和含量測定1【實驗目的】【實驗原理】1.學習稀堿法提取RNA的原理和操作方法。2.了解核酸的組分，并掌握鑒定核酸組分的方法。3.掌握地衣酚顯色法及紫外分光光度法測定酵母RNA含量的原理和方法 酵母核酸中RNA含量較多。RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。2 核糖核酸含有核糖、嘌呤堿、嘧啶堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解，從水解液中可以測出上述組分的存在。 RNA含量測定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常用地衣酚法測定。其反應原理是：當RNA與濃鹽酸共熱時,即發生降解,形成的核糖繼而轉變為糠醛,后

2、者與3,5-二羥基甲苯(地衣酚orcinol)反應,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鮮綠色復合物。3 反應產物在670nm處有最大吸收,RNA濃度在10-100g/ml范圍內,光吸收與RNA濃度成正比。地衣酚法特異性差,凡戊糖均有此反應,DNA和其他雜質也能與地衣酚反應產生類似顏色。因此,測定RNA時可先測得DNA含量再計算RNA含量。41.實驗材料： 酵母粉(或酵母片)【實驗材料和主要儀器、試劑】2.實驗儀器： 研缽、150mL錐形瓶、恒溫水浴鍋、布氏漏斗及抽濾瓶、離心機、漏斗、分光光度計。53.實驗試劑：0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、

3、濃氨水、0.1mol/L硝酸銀溶液 、氯化鐵濃鹽酸溶液、苔黑酚乙醇溶液、鉬酸銨試劑（將2g鉬酸銨溶解在100ml10%硫酸中）、標準RNA母液、標準RNA溶液、樣品溶液、地衣酚-銅離子試劑【實驗材料和主要儀器、試劑】【操作步驟】6 1.RNA的提取：將5g酵母懸浮30mL0.04mol/L氫氧化鈉溶液中，并在乳缽中研磨均勻。將懸浮液轉移至100毫升錐形瓶中。在沸水浴上加熱30分鐘后，冷卻。離心(3000r/min)15分鐘，將上清液緩緩傾入15 mL酸性乙醇溶液中。注意要一邊攪拌一邊緩緩傾入。待核糖核酸沉淀完全后，離心(3000r/min)3分鐘。棄去清液。用95乙醇洗滌沉淀兩次，乙醚洗滌沉淀

4、一次后，再用乙醚將沉淀轉移至布氏漏斗中抽濾。沉淀可在空氣中干燥。7 2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加熱10分鐘。制成水解液并進行組分的鑒定。3.RNA的組分鑒定（1）嘌呤堿 取水解液1mL加入過量濃氨水，然后加入約1 mL 0.1mol/L硝酸銀溶液，觀察有無嘌呤堿的銀化合物絮狀沉淀生成。83.RNA的組分鑒定（2）核糖 取1支試管加人水解液1mL、三氯化鐵濃鹽酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10分鐘。注意溶液是否變成綠色，說明核糖的存在。（3）磷酸 取1支試管，加入1ml水解液，加入5滴濃HNO3和1ml鉬酸銨試劑

5、后，在沸水浴中加熱，觀察有無黃色磷鉬酸銨沉淀產生，說明磷酸是否存在。94.RNA地衣酚法顯色測定（1)標準曲線的制作10（1)標準曲線的制作按上表編號及加入試劑。加畢，搖勻，置沸水浴加熱25min，取出后冷水冷卻，以零號管作對照,于670nm波長處測定各管光吸收值。取測定的平均值,以RNA濃度為橫坐標,光吸收為縱坐標作圖,繪制標準曲線。11(2)樣品的測定取兩支試管,各加入2.0mL樣品注液,再加2.0mL地衣酚-Cu2+試劑，如前述進行測定.(3)RNA含量的計算根據測得的光吸收值,從標準曲線上查出相當該光吸收的RNA含量，計算出制品中RNA的百分含量。12【注意事項】樣品中蛋白質含量較高時

6、,應先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白質后再測定。本法特異性較差,凡屬戊糖均有反應.微量DNA無影響,較多DNA存在時,亦有干擾作用。如在試劑中加入適量CuCl2 .2H2O可減少DNA的干擾。此外,利用RNA和DNA顯色復合物的最大光吸收不同,且在不同時間顯示最大色度加以區分。反應2min后,DNA在600nm呈現最大光吸收,而RNA則在反應15min后,在670nm下呈現最大光吸收。13定磷試劑含有還原劑抗壞血酸，抗壞血酸很容易被空氣中的氧所氧化，使定磷試劑失效。因此可以改用鉬酸銨試劑定磷。核酸分子中的有機磷經強酸消化后形成無機磷，在酸性條件下,無機磷與鉬酸銨結合形成黃色磷鉬酸銨沉淀。14【思考題】1、如何得到高產量RNA粗制品？2、驗證RNA中核糖的辦法，可否用以檢驗脫氧核糖，