1、32PDNA加合物的檢測技術1 1.DNA加合物 DNA加合物是指環境化合物直接或經體內代謝,以及體內自身產生的親電性活性有毒化合物,與DNA堿基上親核的位點特異性結合形成的共價結合物。可與DNA發生加合作用的化學物質包括：烷化劑，多環芳烴，苯乙烯氧化物，醌類，醛類，黃曲霉素，N-亞硝基化合物，雜環芳香胺和丙烯酰胺等。2 四種堿基上易形成加合物的位點如同所示。3 DNA加合物是DNA化學損傷的最重要的形式，并是引發腫瘤過程的病理原因，若形成的DNA加合物不能被生物系統的修復酶及時修復,會引起相關基因發生突變，因此具有遺傳毒性，已有的研究表明許多化學品的致突變、致畸、致癌效應是與DNA加合物的形

2、成有關。 DNA加合物既可作為環境毒性物質靶向暴露劑量的生物接觸標志物，為分析致化學毒害物質的暴露提供手段，又可以作為遺傳毒性和致癌作用的生物效應標志物，為生物體的致癌風險評價提供重要信息。4 2.檢測原理 檢測的基本過程是，首先對樣品DNA進行水解，然后對水解的核苷酸進行非選擇或選擇性32P標記，最后進行分離和測定。因為生物體內加合物的含量極低，要求檢測靈敏度大于0.1-1個/108核苷酸，至少能檢測到每108核苷酸中有1個加成物的水平。5 DNA MN+SPD P1+PAP Xp+Np XpN+N -32PATP 固/液相抽提 -32PATP P1/S1 T4激酶 *pXp+*pNp Xp

3、+N Xp *pXpN TLC T4激酶 -32PATP VPD 測定 *pXp *pX+pN 標準法或 核酸酶P1 頂醇抽提/ 二核苷酸/ 限量AIP法 富集法 HPLC富集法 5-單核苷酸32p后加成DNA加成物的檢測方案 如圖。6符號表示 圖中X表示加合核苷酸，N表示正常核苷酸，左邊的磷酸P表示5端，右邊的表示3端。酶及特性酶特性微球菌核酸酶（MicrococcalNuclease，MN） 是一種內切核酸酶，作用于單鏈及雙鏈核酸，生成3-磷酸末端。對單鏈核酸的作用較好，能較好地分解DNA或RNA的富含AT或AU區域。本酶催化作用不需要Mg2+，但需要Ca2+的存在。脾臟磷酸二酯酶(spl

4、een phosphodiesterase，SPD) 是把具有5-OH末端的DNA、RNA從5-末端向3-端進行逐步降解游離出3-核苷酸的酶。7酶特性核酸酶P1（NucleaseP1） 是一種磷酸二酯酶，具有二酯酶或單酯酶兩重活性，即一是作用于DNA單鏈中的3 ,5 -磷酸二酯鍵，生成5 -核苷酸；二是3分解單核苷酸或寡聚核苷酸中的3-磷酸單酯鍵。檢測中利用了其可以水解正常單核苷酸上的3-磷酸,但難以水解含較大體積加合物的單核苷酸上的3-磷酸,隨后加合的加合的核苷酸可以被T4多核苷酸激酶進行5-32P標記，而正常的則不能。前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，

5、PAP) 可以使脫去單核苷酸或二核苷酸5的磷酸。T4多核苷酸激T4 Polynucleotide Kinase 夠催化P在ATP的位置和多核苷酸（單鏈、雙鏈的DNA、RNA）5羥基末端和核苷3單磷酸核苷之間的轉移與交換。82.1基本方法1）標準方法將DNA用微球菌內切酶（MN）及脾磷酸二酯酶（SPD）消化成單核苷酸（Xp+Np）。T4多聚核苷酸激酶（PNK）催化-32pATP中的32p至單核苷酸的5末端（*pXp+*pNp）。以PEI-纖維素薄層層析分離,用放射自顯影定性。用液閃測定進行定量。92）限量ATP法 在標記反應中不再加入過量的而限制加入ATP的量，由于對加合物核苷酸的標記優于正常核

6、苷酸，從而提高了靈敏度。3）丁醇富集法 在DNA樣品被消化成3-單核苷酸后，加入丁醇及反相試劑四丁基氯化銨，在酸性的條件下抽提富集的加合核苷酸，然后再進行標記。104）核酸酶P1/S1富集法 在進行32P標記前，用核酸酶P1或S1處理3-單核苷酸，正常3-單核苷酸可以被核酸酶P1去磷酸化,而不為T4多聚核苷酸激酶作用,但核酸酶P1不能使3-加合的核苷酸去磷酸化,這樣在進行標記時就只有其被標記上32P。5）HPLC富集法 利用HPLC 分離DNA 的消化混合液,富集被加合的核苷酸,然后進行標記,進而用薄層色譜分離測定。11 6）二核苷酸/5-單磷酸法首先在酸性條件下（PH5.0）,加入核酸酶P1

7、,DNA分子中的正常核苷被水解成5-單磷酸核苷(pN),而被加合的核苷則由于結構改變而對該酶不敏感,其消化產物是5-磷酸二核苷酸(pXpN) 。然后加入前列腺酸性磷酸酶(PAP),5-單磷酸核苷(pN)被進一步酶解成核苷(N),而5-磷酸二核苷酸(pXpN)則被酶解成二聚核苷(XpN)。 最后再加入-32pATP與T4激酶進行標記，被加合的二聚核苷(XpN)被標記為32pXpN,而正常核苷(N)不被標記。也可以再加入蛇毒磷酸二酯酶,進一步將32pXpN酶解成單核苷32pX和pN,然后進行分離測定。12 2.2方法比較 32p后標記法的優點是靈敏度高，不需要復雜的儀器設備，缺點是特異性和穩定性差

8、、步驟繁瑣、不能提供結構信息等。方法 靈敏度應用特點標準法 1000 32P標記效率及靈敏度較低，目前已很少應用。限量ATP法 0.11 提高了靈敏度，但重現性較差，一般用于加合物不能富集的情況。丁醇富集法 0.010.1靈敏度很高，廣泛應用，但對不同種類的加合物的富集效率不同。核酸酶P1 0.010.1靈敏度高，操作簡便，重現性好，廣泛應用，但某些加合核苷亦對核酸酶P1敏感。HPLC富集法 0.11 能將復雜成分的加合物分開，進行定性定量分析，但背景值較高。選擇標記法 0.01 靈敏度高，特別用于富集法回收不完全的情況，為最廣泛應用的方法。13 3.操作過程 3.1標準方法 DNA的酶解過程

9、為，取一份含2.5gDNA樣品的溶制溶液，置1ml聚丙烯離心管用真空離心蒸發器蒸干，然后用含5g（0.6u）微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）,和5g脾磷酸二脂酶（spleep phosphodiesterase）的12l 10mM CaCl2，20mM琥珀酸緩沖液（PH6.0），在370C下消化3h。 參見：32P-Postlabeling Analysis of Aromatic DNA Adducts in Fish from Polluted Areas1. Cancer Research 47, 6543-6548. December 15, 198714 3.

10、2丁醇富集 DNA消化 同標準方法，取5g DNA ,和各5g微球菌核酸酶（Micrococcal Nulease)和脾磷酸二脂酶（spleen phosphodiesterase ）,置12.5l 10mM 琥珀酸緩沖液（pH6.0）: 5mM CaCl2，在370C下消化3h,然后被稀釋成50l。DNA富集 取1g 10l DNA 消化液，與5l 100mM 甲酸銨（pH3.5）和 5l 10mM TBA，及30l的水，置1.5ml的微量離心管，用等體積的丁醇提取兩次，混合液渦旋30秒后用臺式離心機離心1min進行分離，合并提取液并用90l 水反相萃取2次，以除去正常核苷酸的污染，最后丁醇

11、提取液加1 l 200mM Tris-HCl（pH9.5)進行中和。參見：Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen:DNA Adducts. Cancer Research 45, 5656-5662, November 198515 3.3酶P1富集 取12.5gDNA，與750mU微球菌核酸酶 ，12.5mU脾臟磷酸二酯酶，在12.5l的緩沖液（20mM 琥珀酸鈉，8mMCaCl2，pH6.0），于370 C溫育3h，移取2.5l水解液，進行1:1500倍稀釋用以測定正常核苷酸的含量，對

12、于核酸酶P1方案，取10l水解液，加3l含5g（5U）核酸酶P1的緩沖液（0.8M NaAc（pH5.0），2mM ZnCl2），在370C水浴30min后，用3l 427mM tris base 中止反應，然后如前法用丁醇抽提，最后加4l標記混合液（400mM N-二（羥基）甘氨酸（pH9.5），300mM二硫蘇糖醇，200mM MgCl2 ，10mM亞精胺，100Ci-32pATP（15pmol），0.5l 90 M ATP ，10U T4多核苷酸激酶），在室溫下水浴30min，20l 被用于聚乙烯亞胺包被纖維素板薄層層析，并用儲磷屏檢測和定量。16參見：DNA adduct format

13、ion from quaternary benzocphenanthridine alkaloids sanguinarine and chelerythrine as revealed by the 32P-postlabeling technique. Chemico-Biological Interactions 140 (2002) 231242.3.4選擇標記 取3g DNA，加入0.5l Nu.P（1g/l），1lPAP（100U/l），0.5l緩沖液（88mM NaAc，0.5mM ZnCl2，pH5.0）置380C水浴90min，加0.7l 1M CHES-NaOH （pH9.5）終止反應，取1l水解液，溶于300l 10mM Tris-HCl （pH7.5）中，測定OD260值用于計算總核苷酸的濃度。在剩余的4.7l DNA水解液中，加入0.5l PNK（10U/l），1.3l-32pATP(10-15Ci)，0.7l 10PNK緩沖液（0.1M Bicinc-NaOH，0.1M MgCl，0.1M 二硫蘇糖醇，10mM精脒，pH9.5），置于380C水浴90min，然后加入1.7l APy（11mU/l）進一步水解30min，用以水解多余的ATP，最后取6l標記混合液用TCL定性和定量。1